生信分析腎陰虛型絕經后骨質疏松癥分子機制及熟地黃靶向治療

韓林靜 吳克亮 王宏波 肖慶華 張震 朱建宗 林曉生*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2.深圳市中西醫結合醫院，廣東 深圳 518104

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結構退變、骨密度降低，引起骨脆性增加，易發骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。其發病率與年齡呈正相關關系[2]，隨著老齡化的加劇，OP在世界范圍內已經成為繼心血管疾病、糖尿病之后第三大發病率的慢性疾病。據相關研究報道，我國40歲以上人群OP發病率約為25 %[3]，并預計到2050年，我國OP患者將達到2.12億[4]。因此，骨質疏松癥的有效預防與治療已成為當務之急。

中醫認為OP的發生主要與腎虛、脾虛、血瘀有關，其發生的根本病因是腎虛。2019年骨痿指南推薦將絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)分為脾腎陽虛、肝腎陰虛、腎虛血瘀3種證型，并認為肝腎陰虛型最為常見[5]。根據相關統計[6]，在治療陰虛型骨質疏松癥的組方中，熟地黃的使用頻次位列補腎陰藥物的首位，是治療腎陰虛型骨質疏松癥的最基礎藥物。熟地黃性味甘、微溫，歸肝腎經，具有補血養陰，填精益髓的功效。《本經逢源》記載“熟地，藉酒蒸曬，轉苦為甘，性涼變溫，為陰中之陽，故能補腎中元氣”。《本草綱目》有云：“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟”，治“男子五勞七傷”。實驗研究也證實，熟地黃能夠調節糖尿病大鼠的堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平，增加骨礦物質密度，改善骨微結構[7]。體外細胞實驗提示，熟地黃提取物梓醇能夠增加成骨細胞MC3T3-E1的增殖及分化能力[8]。但是熟地黃調節骨代謝，改善骨密度，治療OP的機制仍然不是十分明確。因此，研究熟地黃抗OP的機制，對其進一步開發及利用具有重要意義。

計算機虛擬分子對接技術就是模擬配體(藥物)尋找與受體(蛋白)合適活性位點并結合的過程。分子對接技術為新藥的研發及篩選帶來了極大的便利，可以節約因合成化合物、進行生物活性測試等過程時間，提高效率。分子對接技術還可以代替大量的正交試驗，對研究樣本進行初步篩選，進行樣本優化，減少人力、物力、時間的投入，且結果與正交試驗基本一致[9]。對中藥及其處方研究具有重要意義，是闡述中藥作用機制的重要工具。

1 材料和方法

1.1 設計方案

方案設計見圖1。

圖1 方案設計圖Fig.1 Scheme design drawing

1.2 芯片檢索及差異表達分析

通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO數據庫，按照“osteoporosis”、“kidney yin dificiency”進行搜索，篩選物種為人的基因表達芯片，并使用在線分析軟件GEO2R進行在線差異表達分析(選擇系統默認推薦設置)，將分析結果保存為文本文件備用，運用Origin2019b 64Bit版繪制差異表達火山圖。

1.3 獲取陰虛型OP靶點

通過GeneCards(https://www.genecards.org)及OMIM在線數據庫(https://www.omim.org)，輸入“Osteoporosis”進行檢索與骨質疏松癥相關的基因，設置關聯分數(relevance score)≥5，結果與2.1差異基因運用R軟件進行映射匹配，得到腎陰虛型OP的靶點基因。

1.4 蛋白互作(PPI)網絡建立

將2.2獲得蛋白輸入STRING數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl，Version11.0)，設置物種為人類(Homo spaiens)進行構建，設置可信度為中等可信(medium confidence)，隱藏未連接的節點，其他參數保持數據庫系統推薦設置，進行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關系網絡，按照連接度值(Degree)確定前10位為核心蛋白。

1.5 熟地黃有效成分獲取

中藥藥理學系統數據庫TCMSP(traditional Chinese medicine system pharmacology, http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索熟地黃的化學成分，按口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行篩選[10]。

1.6 蛋白及小分子結構文件獲取

通過PDB(protein data bank, http://www.rcsb.org/)數據庫獲取核心靶點蛋白3D結構，保存為pdb文件；ZINC(http://zinc.docking.org/)數據庫獲取2.4藥物小分子3D結構，保存為mol2文件。

1.7 計算機分子對接

運用AUTODOCK 4.2及其工具MGLTools-1.5.6軟件進行分子對接，對所有對象先進行加氫，計算電荷；在Docking模塊設置蛋白大分子對接方式為剛性(Rigid)，將獲取3D結構的蛋白逐一與藥物小分子進行計算機分子對接，并且以結合能(binding energy)≤-5.0 kJ/mol[11]作為對接成功標準，分析熟地有效成分發揮作用的靶點。

1.8 GO生物過程及KEGG通路富集分析

將腎陰虛型絕經后骨質疏松癥的靶點基因輸入到數據庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，Version6.8)，選擇物種為人類(Homo spaiens)進行GO生物過程和KEGG信號通路富集，分析陰虛型PMOP的生物過程及主要信號通路，探討陰虛型PMOP的病理機制。

2 結果

2.1 差異表達基因

按照檢索詞在GEO數據庫進行檢索，最終得到福建省中醫藥研究院研究團隊共享的腎陰虛型絕經后骨質疏松癥的基因表達芯片(GEO編號：GSE56116)。對其在線分析結果以log2FC=1(差異2倍以上)，P<0.05為條件，運用Origin2019b 64Bit版對差異表達結果進行火山圖繪制，結果顯示與正常對照組相比，腎陰虛型OP患者血液中低表達的基因有725個，高表達的有675個(見圖2)。

2.2 陰虛型OP靶點

運用R軟件中的韋恩圖繪制包(Venn Diagram)對2.1差異表達基因與GeneCards、OMIM數據庫獲取的OP相關基因匹配映射，去除重復，共得到腎陰虛型PMOP靶點基因45個，見圖3。

圖3 陰虛靶點與OP靶點匹配維恩圖Fig.3 Venn diagram of the targets of yin-deficiency and OP matching

2.3 PPI蛋白互作

將45個陰虛型OP靶點基因導入string數據庫，在線繪制互作網絡圖，隱藏未連接的靶點，得到蛋白互作網絡，見圖4。通過PBD數據庫獲得連接度值前十的基因編碼蛋白結構文件(表1)。

圖4 PPI網絡Fig.4 Network of PPI

表1 蛋白編碼信息Table 1 Protein coding information

2.4 熟地黃活性成分及結構

按條件篩選獲得熟地黃活性成分2種，分別為谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)，ZINC數據庫獲取兩者的3D結構見圖5。

注：a為sitosterol(ZINC4095717)；b為stigmasterol(ZINC4096712)。圖5 藥物的3D結構Fig.5 3D structure of active ingredients

2.5 對接結果

將PDB數據庫中獲取的10個核心蛋白逐一與兩個小分子進行對接，按照標準sitosterol、stigmasterol對接成功的分別有9種、10種，結果見表2；sitosterol與APOB結合能最高為-7.53 kJ/mol，并能夠形成氫鍵，見圖5a。stigmasterol與CCND1結合能最高為-6.44 kJ/mol，形成共價氫鍵，見圖5b。

表2 對接結果Table 2 Docking results of some proteins vs ingredients

注：a：sitosterol與APOB對接結果；b：stigmasterol與CCND1對接結果。圖中綠色表示蛋白結構，藍色表示蛋白氨基酸殘基，紅色表示藥物小分子，黃色表示形成的氫鍵，黑色數值表示形成氫鍵的氨基酸殘基序號。圖6 結合能最高的對接結果Fig.6 Docking results with the highest binding energy of ingredients

表3 KEGG通路富集結果Table 3 Results of KEGG pathway enrichment

2.6 富集結果

將腎陰虛型PMOP基因導入到DAVID數據庫進行在線富集分析，GO富集見圖6，結果顯示GO生物學過程(biological process，GO-BP)參與骨骼肌系統發育、雌激素應答、細胞凋亡過程調節等；細胞組分(cellular component，GO-CC)有細胞外基質、內質網、胰島素樣生長因子復合體等；分子功能(molecular function，GO-MF)配受體活性、配受體結合、生長因子受體結合等。KEGG通路富集見表3，富集的通路有卵巢類固醇生成、Wnt信號通路、PI3K-Akt、Jak-STAT等信號通路。

圖7 GO富集結果Fig.7 Results of GO enrichment

3 討論

基因表達譜芯片(GSE56116)原始資料共含有10個研究對象的血液樣本，其中有4個為陰虛型絕經后骨質疏松癥患者血液樣本，3個為陽虛型(未納入分析)，3個健康研究對象樣本。以健康者基因表達為對照，分析陰虛型絕經后骨質疏松癥患者血液樣本差異表達基因，將過表達或者低表達的基因于骨質疏松相關基因進行映射匹配，結果可能就是陰虛型PMOP相關的靶基因，通過對靶基因分析，得出陰虛型PMOP的病理機制。

PPI蛋白互作網絡顯示，IGF1、VEGFA的連接度值最高，位于網絡的中心位置，為陰虛型OP發生機制的關鍵基因。雌激素應答、細胞凋亡過程調節等是細胞的主要生物學過程，該過程主要由PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路等調節。IGF1(胰島素樣生長因子1)是PI3K/Akt信號通路的激活劑，IGF1可以激活PI3K[12]。PI3K激活后并促進下游靶蛋白Akt的激活，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的Akt可以繼續作用于下游凋亡靶蛋白[13]，影響細胞凋亡相關蛋白(Bcl2、Bax)活性，調節細胞凋亡[14]。雌激素的應答過程主要有MAPK、Ras、Rap1等信號通路調節。外界因素作用于鳥苷酸交換因子上(SOS、C3G等)，信號則轉導至小分子 GTP 結合蛋白 (Ras，Rap1)[15]，后者再激活級聯中的核心單位，包括一個 MAPKKK (Raf)、一個 MAPKK (MEK1/2) 和 MAPK (Erk)[16]。激活的 Erk 二聚物可在胞質中調控靶蛋白，也可轉運入胞核，在核內磷酸化多種調控基因表達的轉錄因子[17]。而且不同生物過程中的調控通路是相互影響的[18](見圖8)。因此，腎陰虛型骨質疏松癥的病理機制可能是上述通路調節的細胞凋亡、雌激素應答等過程。

本研究共獲得兩種熟地黃的有效成分，sitosterol(谷甾醇)、stigmasterol(豆甾醇)。10個分子對接成功結果中，谷甾醇與APOB(載脂蛋白B)形成氫鍵緊密結合。腫瘤骨轉移患者血清APOB升高，APOA1降低，APOA1/APOB比值降低，糖脂代謝紊亂[19]。APOB是低密度脂蛋白(LDL)及極低密度脂蛋白的轉運載體，能夠促進細胞對膽固醇及LDL的吸收[20]，成骨細胞中脂質的積累會抑制其骨形成的活性，骨髓干細胞脂肪形成的增加，還可誘導破骨細胞分化，造成骨量流失[21]。另外，谷甾醇在腸道中的吸收與APOB水平相關，這種關系是正向的[22]。谷甾醇可以調節IGF1的表達，動物實驗[23]中，植物雌激素環境中(sitosterol)，虹鱒肝臟內IGF1的mRNA的表達明顯下調。豆甾醇與CCND1(細胞周期蛋白D1)編碼的蛋白結合最為緊密，且蛋白A鏈的238號氨基酸殘基上與藥物形成一個氫鍵。CCND1是細胞周期的正調節蛋白，參與了細胞增殖、分化和細胞凋亡等過程。阿吉木[24]報道Wnt/β-catenin信號通路能夠靶向CCND1，促進MG63骨肉瘤細胞的增殖及分化，此研究也應證了通路富集結果。豆甾醇可以調控大鼠VEGFA蛋白表達，(4.34±1.64)μg/mL牛蒡子[25]的乙醇提取物(主要成分為谷甾醇及豆甾醇)可以降低大鼠VEGFA(血管內皮生長因子A)的表達，抗血管生成。普遍認為VEGFA能夠促進新生血管形成，促進骨修復[26]。但近來也有研究表明，過表達VEGFA對促進骨髓間充質干細胞成骨分化并無益處[27]。因此，有待進一步研究證實。

圖8 預測機制圖Fig.8 Potential mechanism diagram

綜上所述，腎陰虛型絕經后骨質疏松癥的發生機制可能與PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路調節的細胞凋亡及雌激素應答有關。熟地黃治療腎陰虛型絕經后骨質疏松癥的機制可能是其有效成分作用于IGF1、VEGFA、APOB等靶蛋白，而發揮藥效作用。本研究不足之處在于，通過分子對接預測藥物有效成分作用靶蛋白，尚缺乏在骨質疏松領域的直接證據，有待進一步驗證。