甲狀腺乳頭狀癌患者血清miR-21、miR-221、miR-146a水平變化及其與臨床特征的關系

陳霖霖，李正東，金從穩，劉浩，陳本鑫

皖西衛生職業學院附屬醫院，安徽六安237000

近年來甲狀腺癌的發病率不斷增加，研究顯示有5%～15%的甲狀腺結節最終確診為甲狀腺癌［1］；其中甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型，多數患者可采用手術治療。目前PTC 術前診斷的金標準是采用細針穿刺細胞學技術活檢［2］，然而該項技術操作難度較高，患者依從性差，因此探討診斷PTC的簡便、有效方式具有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是一種核苷酸內源性非編碼單鏈RNA，能夠調控基因的表達［3］，甲狀腺癌組織中miR-21、miR-221、miR-146a 的表達水平可出現明顯異常［4-5］。目前關于診斷PTC 的血清標志物的研究仍處在初級階段，故本研究探討血清miR-21、miR-221、miR-146a 的聯合檢測對PTC 的診斷價值，并分析其與臨床特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年6 月—2020 年6 月皖西衛生職業學院附屬醫院收治的85 例甲狀腺結節患者為研究對象，根據術后病理學診斷結果分為觀察組（PTC患者）和對照組（良性結節患者）。觀察組43例，男18例、女25例，年齡35～63（49.21±6.92）歲。對照組42 例，男19 例、女23 例，年齡37～66（48.91±7.01）歲。觀察組納入標準：①符合PTC的診斷標準［6］，并經病理學確診；②臨床資料完整；③精神狀態正常，能配合治療。觀察組排除標準：①其他病理類型甲狀腺癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③重要器官功能障礙；④腫瘤遠處轉移；⑤術前接受過化療或放療患者。兩組患者性別構成及年齡比較差異無統計學意義（P均＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 血清miRNA 的檢測 空腹狀態下采集患者外周靜脈血5 mL 置于血清分離管內，充分混勻并置于室溫下。將試管置于3 000 r/min 的離心機內充分離心15 min，獲取所得上層血清，將其分為兩等份后置于EP 管內，并保存于-80 ℃冰箱內。應用實時免疫熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測兩組血清中miR-21、miR-221、miR-146a 的表達水平。使用RecoverAll TM 核酸分離試劑盒從所得血清中提取總體RNA。cDNA 逆轉錄和RT-PCR 根據相關說明書，使用全合一的TM-miRNA 和RT-PCR 檢測試劑盒進行。PCR 反應在95 °C 下預熱10 min，然后在95 °C 下變性40 個循環，每次10 s，在60 °C 下退火20 s，在72°C 下延伸10 s。miRNA 的引物序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設計。miR-21 上游引物：5'-GGGGTAGCTTATCAGACTG-3'，下游引物：5'-TGGAGTCGGCAATTGCACTG-3'。miR-221 上 游引 物：5'-TTGAGAAGTTTGTGCAGTCG-3'，下 游 引物：5'-TGCGTATACACTTTGGCAT-3'。miR-146a 上游引物：5'-TGTTGCTGAAGAGCTCTGGTAC -3'，下游 引 物：5'-TCGTCTGATGATGTCGAATGTAC-3'。內參U6 上游引物：5'-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每個樣本重復進行3 次，以U6 作為內參，并 通 過2-ΔΔCt方 法 計 算miR-21、miR-221、miR-146a的相對含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關系數檢驗。使用受試者工作特征（ROC）曲線評價檢測指標對PTC 的診斷性能，曲線下面積（AUC）越大，其診斷價值越高，AUC的比較采用z檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表達 觀察組血清miR-21、miR-221 表達水平高于對照組，miR-146a 表達水平低于對照組，差異具有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-21、miR-221、miR-146a表達水平比較（±s）

表1 兩組血清miR-21、miR-221、miR-146a表達水平比較（±s）

組別觀察組對照組n 43 42 t P miR-21 3.05±1.03 1.13±0.34 8.367＜0.05 miR-221 2.98±0.95 1.09±0.24 9.021＜0.05 miR-146a 0.85±0.23 1.69±0.48 6.517＜0.05

2.2 不同臨床特征PTC 患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表達 PTC 患者中腫瘤長徑＞2 cm、有包膜侵犯、臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移患者血清miR-21、miR-221 表達水平增加，miR-146a 表達水平降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表達比較（±s）

表2 不同臨床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表達比較（±s）

臨床特征性別n miR-21-x±s t p miR-221-x±s t p miR-146a-x±s t p 0.321 0.109 0.506 0.115 0.431 0.124男 女18 25 2.98±0.95 3.07±1.05 2.95±0.94 3.01±0.98 0.83±0.22 0.86±0.27年齡（歲）≥50＜50病灶單發多發腫瘤長徑（cm）＞2≤2包膜侵犯有 無臨床分期（期）Ⅰ～ⅡⅢ淋巴結轉移有 無26 17 21 22 24 19 22 21 17 26 23 20 3.09±1.08 3.02±0.98 2.97±0.92 3.08±1.06 3.86±1.05 2.98±0.84 3.91±1.06 2.91±0.82 2.89±0.81 3.64±1.03 3.49±1.23 2.67±0.71 0.806 0.901 6.521 7.806 8.237 7.624 0.104 0.127 0.018 0.002 0.001 0.004 2.99±0.97 2.96±0.94 3.06±1.04 2.95±0.91 3.61±1.02 2.91±0.82 3.75±1.08 2.82±0.75 2.79±0.81 3.49±1.13 3.52±1.08 2.64±0.57 0.781 0.896 6.631 6.917 7.813 8.226 0.124 0.157 0.016 0.005 0.002 0.001 0.89±0.28 0.82±0.21 0.88±0.24 0.84±0.21 0.69±0.18 0.98±0.26 0.64±0.16 0.99±0.25 0.97±0.29 0.79±0.17 0.71±0.14 0.98±0.29 0.534 0.754 4.987 5.138 5.037 6.807 0.137 0.137 0.023 0.017 0.019 0.009 TI-RADS分級0.719 0.208 0.697 0.217 0.904 1.135 4 5 34 9 3.07±1.04 2.99±0.94 2.99±0.96 2.96±0.93 0.89±0.26 0.81±0.21

2.3 PTC 患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表達的相關性 經Pearson 相關性分析顯示，PTC 患者血清miR-21 與miR-221 表達呈正相關（r=0.738，P＜0.05），miR-146a 與miR-21 及miR-221 表達呈負相關（r分別為-0.726、-0.599，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-21、miR-221、miR-146a 診斷PTC 的ROC 曲線 血清miR-21、miR-221、miR-146a 診斷PTC 的AUC分別為0.790、0.796、0.289，三者聯合診斷PTC 的AUC為0.914，均高于單獨指標的診斷價值（z分別為2.934、2.817、3.014，P均＜0.05）。

3 討論

PTC 生物學惰性較高，多數患者預后較好，然而仍有報道顯示接近10%～30%的PTC 患者確診時已出現轉移，影響患者預后［7］，因此早期診斷治療PTC具有重要的臨床意義。目前臨床上多采用穿刺活檢法確診PTC，但其對臨床醫師操作、制作切片等技術要求較高，同時屬于有創操作，部分患者難以接受［8］。目前采用血清學腫瘤標志物診斷PTC 簡單、迅速，但仍存在靈敏度和特異性較低等問題，因此探討各類血清腫瘤標志物的單獨及聯合檢測價值日益迫切。

miRNA 是存在于真核生物體內的一種非編碼單鏈RNA，可作為原癌基因及抑癌基因參與腫瘤生物學途徑［9］。研究表明，早期食管癌患者血清miRNA-19a、miRNA-9 表達水平明顯增加，miRNA-218表達水平明顯降低，三者聯合診斷早期食管癌的敏感度達90.00%、特異度達92.50%［3］。本研究表明，觀察組患者血清miR-21、miR-221 表達高于對照組，而miR-146a 表達水平降低，進一步行Pearson 相關性分析顯示，miR-21與miR-221表達呈正相關，miR-146a 與miR-21 及miR-221 表達呈負相關，PTC 患者血清中上述miRNA 指標出現明顯異常。這與既往多項臨床研究結論一致［10-12］。上述研究主要以探討單項miRNA 在甲狀腺癌中的表達為主，目前仍缺乏多項血清miRNA 指標的聯合檢測在甲狀腺癌診斷及預后中的應用。本研究采用ROC 曲線評估miR-21、miR-221 及miR-146a 的單獨及聯合檢測在診斷PTC 中的價值，結果顯示三項指標AUC分別為0.790、0.796、0.289，而聯合檢測診斷PTC 的AUC達0.914。筆者認為由于miRNA 檢測操作簡便，患者易接受，臨床上miR-21、miR-221、miR-146a 聯合檢測能明顯提高PTC 的診斷價值，這對于PTC 的早期篩查具有重要的臨床意義。

本研究分析不同臨床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表達水平發現，腫瘤長徑＞2 cm、有包膜侵犯、臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移患者血清miR-21、miR-221 表達水平增加，而miR-146a 表達水平降低，這表明miR-21、miR-221、miR-146a 表達水平對腫瘤惡性程度也有一定的指示作用。miR-21位于人體17q23.2 號染色體位置，具有明顯的原癌基因性質。研究顯示，miR-21 在PTC 組織中表達水平較高，且高表達與腫瘤浸潤相關［13］，主要是與miR-21 可抑制下游靶基因的轉錄與翻譯，繼而促進腫瘤細胞增殖與侵襲有關［14］。研究顯示，在多種惡性腫瘤中miR-221 可通過下調PTEN 來增強Akt 的磷酸化發揮致癌性［15］。因此miR-221 對PTC 惡性程度的影響也可能與下調PTEN 從而增強Akt 信號通路有關。miR-146a 能夠啟動細胞增殖，通過與靶RNA的特異性結合抑制RNA翻譯，miR-146a蛋白表達減少會降低腫瘤細胞的黏附能力，繼而抑制腫瘤的轉移［16］，未來miR-146a 蛋白可能成為PTC 靶向治療的分子靶點。

綜上所述，PTC 患者血清miR-21、miRNA-22l 表達明顯上調，而miR-146a 表達水平下降，三者均可作為判斷腫瘤生物學活性的有效指標，三者聯合檢測可明顯提高PTC的診斷價值。