重組巨細(xì)胞病毒多肽檢測(cè)特異性IgG抗體及抗體親合力指數(shù)的評(píng)價(jià)

陳潔，江源，馮靜，周乙華，胡婭莉，戴毅敏

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京210008

巨細(xì)胞病毒（CMV）宮內(nèi)感染是引起胎兒畸形的重要病原體［1］，CMV 宮內(nèi)感染對(duì)胎兒的影響程度與母體孕期CMV感染類型有關(guān)［2-3］，CMV IgG親合力指數(shù)（AI）檢測(cè)是目前公認(rèn)能夠有效區(qū)分CMV 感染類型的方法［4］。CMV 有超過(guò)200 個(gè)開放閱讀框，編碼的多種蛋白可設(shè)計(jì)作為重組抗原檢測(cè)特異性IgG抗體。既往研究報(bào)道顯示，CMV 的被膜磷蛋白150（pp150）、pp28、包膜糖蛋白gB（gB）及非結(jié)構(gòu)蛋白pp52 等能被大部分CMV IgG 陽(yáng)性血清識(shí)別，因而可能替代全病毒抗原用于檢測(cè)CMV IgG 抗體［5-6］。本研究中，我們選取與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)IgG 一致性較好的重組多肽進(jìn)一步用于檢測(cè)CMV IgG AI，即在重組多肽ELISA 基礎(chǔ)上引入尿素變性處理［7］，使低親合力抗體與抗原的結(jié)合明顯減少，而幾乎不影響高親合力抗體與抗原的結(jié)合，從而判斷重組多肽是否同時(shí)適合用于CMV IgG AI 檢測(cè)以正確區(qū)分患者CMV感染類型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2006-2009年采集并保存南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院41例新生兒出生后1、3.5、8個(gè)月和2歲時(shí)的外周血，以進(jìn)口試劑檢測(cè)血清CMV IgG，隨訪至2歲，9例未見感染CMV，32例在2歲前首次感染CMV。2011年6月—9月隨機(jī)采集南京市0～8歲兒童200 例血清，其中CMV IgG 陰性74 例、CMV IgG 陽(yáng)性126例，用于初步評(píng)估重組多肽的抗原性。另外，從上述隨訪期間明確首次感染的32例嬰幼兒中隨機(jī)挑選8例原發(fā)感染血清以及7例確定為潛在感染血清，以初步判斷重組多肽是否同時(shí)適合IgG AI檢測(cè)。

1.2 重組多肽抗原的制備 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取在人群中高度保守且編碼蛋白能被大部分CMV IgG陽(yáng)性血清識(shí)別的基因片段及相應(yīng)的引物序列，以CMV感染患者的外周血白細(xì)胞DNA 為模板，采用巢式PCR 擴(kuò)增目的基因片段。參考本實(shí)驗(yàn)室既往方法［8］，應(yīng)用分子克隆技術(shù)將擴(kuò)增的各基因片段克隆入表達(dá)載體pRSET-A（美國(guó)Invitrogen 公司）合成重組蛋白多肽。用Ni-NTA瓊脂糖凝膠層析方法（德國(guó)Qiagen 公司）純化重組蛋白，從而分別獲得高純度8種重組多肽，即pp150/1、pp150/2、pp150/3、pp150/4、pp52/1、pp52/2、pp28、gB。

1.3 重組多肽檢測(cè)血清CMV IgG 隨機(jī)挑選經(jīng)CMV IgG ELISA 進(jìn)口 試劑盒檢測(cè)126 例CMV IgG 陽(yáng)性和74例CMV IgG陰性標(biāo)本［11］，采用ELISA法以重組多肽檢測(cè)血清CMV IgG表達(dá)。將純化的8種重組多肽分別稀釋于碳酸鹽包被緩沖液，終濃度為1 μg/mL，100 μL/孔，包被96 孔板，4 °C 過(guò)夜。次日甩凈、拍干，PBST 洗滌3 次，每孔加300 μL 封閉液（5%脫脂奶-PBST），37 °C 封閉1 h；甩凈、拍干后，每孔加入100 μL 用封閉液1∶100 稀釋的待測(cè)血清樣本、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，空白孔空置；37°C 溫育1 h；PBST洗滌5 次，甩干、拍凈后每孔加100 μL 用1×PBST 1：4000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗人IgG 抗體，空白孔除外；37°C 溫育1 h；PBST 洗滌5 次后拍干，加入四甲基聯(lián)苯胺；室溫避光孵育15 min 后，每孔加100 μL 0.3 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀讀取450 nm 吸光度OD 值。結(jié)果判斷：待測(cè)血清樣本OD 值＞陰性對(duì)照+2s時(shí)，判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 重組多肽檢測(cè)血清CMV IgG AI 在重組多肽ELISA 法基礎(chǔ)上引入8 mol/L 尿素變性；抗原包被同重組多肽ELISA 法，用5%脫脂奶-PBST 稀釋待測(cè)血清，至CMV IgG 濃度在8 IU/mL 左右［9］。微孔板上對(duì)應(yīng)兩孔，分別加入50 μL 稀釋后待測(cè)血清；然后其中一孔設(shè)為參照孔，再加入50 μL 1×PBST；另一孔為變性孔，再加入50 μL 8 mol/L 尿素（1×PBST 稀釋）。其余步驟同重組多肽ELISA 法。結(jié)果判定：AI=（變性孔OD值/參照孔OD值）×100%。

1.5 進(jìn)口試劑檢測(cè)CMV IgG 抗體及IgG AI 采用固相酶聯(lián)免疫法試劑（意大利DIA.PRO公司）檢測(cè)血清中CMV IgG抗體。血清標(biāo)本用稀釋液1∶100稀釋，檢測(cè)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，每次均設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。CMV IgG AI檢測(cè)采用與CMV IgG檢測(cè)相同的試劑盒進(jìn)行，采用本研究室建立的方法檢測(cè)抗體親合力［7］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用R×C列表卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組多肽抗原成功制備的驗(yàn)證 利用重組多肽在氨基端的His6標(biāo)識(shí)，用抗His6單克隆抗體檢測(cè)，免疫印跡法顯示在對(duì)應(yīng)預(yù)期分子質(zhì)量大小位置附近均可見棕色條帶，提示抗His6單克隆抗體能與各重組多肽表達(dá)的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明基因表達(dá)閱讀框正確。見圖1。

圖1 8種重組多肽的條帶表達(dá)

2.2 重組抗原檢測(cè)血清CMV IgG 表達(dá)情況 將CMV IgG ELISA 進(jìn)口試劑盒檢測(cè)的126 例CMV IgG陽(yáng)性和74 例CMV IgG 陰性標(biāo)本，與8 種重組抗原檢測(cè)血清CMV IgG 表達(dá)情況進(jìn)行比較，顯示126 例CMV IgG陽(yáng)性標(biāo)本，pp150/4檢測(cè)血清特異性抗體陽(yáng)性符合率為90.9%（100/110，存在檢測(cè)血清樣本量不足情況），重組抗原pp150/2 和pp150/3 檢測(cè)陽(yáng)性符合率亦分別為89.7%（113/126）和88.9%（112/126）；74 例CMV IgG 陰性標(biāo)本，重組抗原gB 檢測(cè)陰性符合率為98.6%（73/74），重組抗原pp150/2、pp150/3 和pp150/4 的陰性符合率分別為94.6%（70/74）、95.9%（71/74）和97.0%（64/66，存在檢測(cè)血清樣本量不足情況）。與進(jìn)口ELISA試劑盒比較，重組多肽pp150 檢測(cè)CMV IgG 抗體的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.3 重組抗原檢測(cè)血清CMV IgG AI 情況 根據(jù)重組抗原ELISA 檢測(cè)CMV IgG 的結(jié)果，我們選取陽(yáng)性和陰性符合率均相對(duì)較高的重組抗原pp150/2、pp150/3 和pp150/4，進(jìn)一步檢測(cè)8 例明確原發(fā)感染的嬰幼兒血清、7 例確定為潛在感染的兒童血清的CMV IgG AI。8 例經(jīng)進(jìn)口試劑確定為原發(fā)感染血清的AI 值為15.3%～29.8%；以重組抗原pp150/4 檢測(cè)時(shí)，4 例AI 值＜30%，4 例AI 值＞30%（39.0%～60.4%），與進(jìn)口試劑檢測(cè)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。7例明確為潛在感染的血清進(jìn)口試劑AI 值為59.6%～92.3%，2 例經(jīng)重組抗原檢測(cè)AI 值分別為22.9%和25.1%，與進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。同樣，利用重組抗原pp150/2和pp150/3檢測(cè)的IgG AI值與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表1 重組抗原檢測(cè)血清CMV IgG表達(dá)與進(jìn)口試劑盒比較（例）

表2 重組抗原檢測(cè)血清CMV IgG AI與進(jìn)口試劑結(jié)果比較（%）

3 討論

ELISA 檢測(cè)血清特異性抗體具有靈敏、特異、快速、方便的特點(diǎn)，故在臨床診斷中廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道多種CMV 重組多肽表達(dá)的蛋白可用于CMV 抗體檢測(cè)，主要包括蛋白pp150、pp52、pp28 及gB 等［9-11］，其靈敏度及特異性各有差異。本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了8 種含有CMV 多肽基因序列的表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了純化的蛋白多肽，進(jìn)一步以此為基礎(chǔ)建立了間接ELISA 檢測(cè)CMV IgG 抗體。在比較重組多肽ELISA 與進(jìn)口ELISA 試劑盒的檢測(cè)一致性時(shí)發(fā)現(xiàn)，8 種重組抗原均顯示了較高的陰性符合率，尤其是gB 多肽。但同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)部分經(jīng)進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)為陰性血清樣本在重組多肽檢測(cè)時(shí)判斷為陽(yáng)性，推測(cè)可能為重組抗原的非特異性吸附導(dǎo)致的假陽(yáng)性。此外，我們發(fā)現(xiàn)重組多肽pp150 檢測(cè)血清IgG 抗體的陽(yáng)性符合率明顯優(yōu)于其他重組多肽pp52、pp28 和gB，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相一致［12］。進(jìn)一步比較pp150的4個(gè)截短多肽，可以發(fā)現(xiàn)羧基端的重組多肽（pp150/2、pp150/3、pp150/4）的陽(yáng)性符合率相近，且高于氨基端的重組多肽pp150/1，提示pp150蛋白的主要抗原表位位于其羧基端。另外，雖然pp150羧基端的重組多肽檢測(cè)特異性抗體時(shí)陽(yáng)性符合率較高，但并未能檢出所有陽(yáng)性血清。有研究發(fā)現(xiàn)［13］，多個(gè)抗原性多肽片段融合后的血清反應(yīng)陽(yáng)性率通常高于單一多肽抗原。因此，構(gòu)建多個(gè)基因片段的表達(dá)質(zhì)粒以獲取重組融合蛋白，如pp150多肽片段或與pp52、pp28等其他重組多肽，或嘗試將幾種單獨(dú)表達(dá)的重組抗原混合后作為包被抗原，以評(píng)估是否能提高CMV特異性抗體的陽(yáng)性檢出率。

CMV IgG AI 檢測(cè)有助于正確判斷孕婦CMV 感染類型。目前國(guó)外已有CMV IgG AI 檢測(cè)試劑盒上市，質(zhì)量較好，診斷價(jià)值可靠，但價(jià)格較為昂貴。而目前國(guó)內(nèi)雖然有CMV IgG ELISA 檢測(cè)試劑盒，但并無(wú)適合于AI檢測(cè)的相關(guān)試劑盒。本研究中，我們選取與試劑盒檢測(cè)IgG 一致性較好的重組多肽進(jìn)一步檢測(cè)AI，即在重組多肽ELISA 基礎(chǔ)上引入尿素變性處理，以探討重組抗原是否同時(shí)適合于AI檢測(cè)。由于CMV IgG 抗體濃度對(duì)AI 的檢測(cè)存在影響［14］，我們預(yù)先適當(dāng)比例稀釋血清標(biāo)本以調(diào)整IgG 濃度在合適的范圍［15］。盡管利用重組多肽僅檢測(cè)了小部分確定為原發(fā)感染或潛在感染的血清，然而初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)重組多肽檢測(cè)AI值判斷的感染狀態(tài)與實(shí)際感染狀態(tài)的一致性較差，尤其是檢測(cè)原發(fā)感染血清時(shí)。因此，盡管本研究構(gòu)建的CMV 重組多肽雖然在檢測(cè)特異性IgG 抗體時(shí)具有較好的反應(yīng)性，但并不適合于AI檢測(cè)，推測(cè)可能是由于通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)的重組蛋白與全病毒培養(yǎng)獲得的抗原構(gòu)象不同所致。因此，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)如表達(dá)其他重組多肽抗原或者通過(guò)全病毒培養(yǎng)、純化獲取相關(guān)抗原，以建立同時(shí)適合于CMV IgG AI檢測(cè)的ELISA試劑。