IL-18對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用

倪飛飛，徐慶，王亞輝，李建軍

1 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004；2 天津市天津醫(yī)院；3 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安市人民醫(yī)院

隨著當(dāng)今社會經(jīng)濟(jì)和交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，多發(fā)性骨折合并腦、肺、腹腔臟器損傷患者有增加趨勢，臨床治療面臨很多挑戰(zhàn)。脾破裂合并肢體骨折是臨床常見的高能量多發(fā)傷，全脾切除是其首要急救措施。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合外傷骨折合并脾破裂而行脾切除的患者中骨折愈合明顯延遲，考慮與脾切除后機(jī)體免疫炎性功能改變導(dǎo)致與骨折愈合相關(guān)的炎性因子明顯減少進(jìn)而影響骨折愈合有關(guān)［1-2］。IL-18 屬于IL-1 家族，是前炎癥細(xì)胞因子之一。研究顯示IL-18 在骨缺損修復(fù)過程中起重要作用，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）、成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞均有影響，但具體機(jī)制尚不明郎［3-4］。IL-18 主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而脾臟是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，內(nèi)含豐富巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及炎性因子同時能高效表達(dá)IL-18，這些免疫細(xì)胞及炎性因子與機(jī)體損傷修復(fù)密切相關(guān)［5-6］。研究表明，骨折后BMSC 會首先募集到骨折處，第一時間參與骨折修復(fù)；骨折后BMSC 所處的骨折微環(huán)境對細(xì)胞分化及功能發(fā)揮起著重要調(diào)節(jié)作用，骨損傷后骨折斷端局部為血腫炎性微環(huán)境［7］，炎性細(xì)胞因子對BMSC成骨分化可能存在促進(jìn)或抑制作用。因此有必要進(jìn)一步探究細(xì)胞因子IL-18對BMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC，中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院干細(xì)胞研究中心提供）、重組人IL-18（美國R&D 公司）、DMEM- F12 培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（無錫依科賽）、青霉素、鏈霉素（大連美倫）、胰蛋白酶（美國Gibco）、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸（美國Sigma 公司）、茜素紅S（碧云天公司）、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（碧云天公司）、特異性轉(zhuǎn)錄因子-2（Runx2）一抗（Proteintech 公司）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP2）一抗（Proteintech 公司）、骨橋蛋白（OPN）一抗（Proteintech公司）、GAPDH一抗（Proteintech 公司）、兔二抗（北京中杉金橋）、PCR引物、PCR試劑盒、DEPC水和Trizol試劑均購于Takara公司；高速低溫離心機(jī)和CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）、倒置相差顯微鏡+圖像采集系統(tǒng)（Nikon，Eclipse NI）、熒光定量PCR儀（美國Life technologies，ABI7500 Fast），一次性25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔培養(yǎng)板、離心管等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材（無錫Nest 公司）、細(xì)胞破碎儀（美國Next advance，BBY24M）。

1.2 hBMSC 培養(yǎng) 取原代hBMSC 置于DMEM-F12生長培養(yǎng)液（含89%F12-DMEM、15%FBS、1%青-鏈霉素），放于37 ℃、5%CO2，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行首次換液棄除非貼壁細(xì)胞，之后每隔48 h 進(jìn)行1次換液，當(dāng)細(xì)胞貼壁大約90%時進(jìn)行傳代，選用長勢良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.3 經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液的配制 在上述DMEM-F12生長培養(yǎng)液基礎(chǔ)上配制成骨誘導(dǎo)液，終濃度分別為：地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉3.3 mmol/L、維生素C 16.67 mg/L。無菌條件下用DMEM-F12生長培養(yǎng)液定容至100 mL，充分混勻，4 ℃保存。

1.4 hBMSCs 分組 取生長良好的第3 代hBMSC每孔2×104個接種于6 孔培養(yǎng)板，并隨機(jī)分成兩組。于細(xì)胞匯合率為80%～90%時，對照組采用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，觀察組采用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液+質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的重組人IL-18 培養(yǎng)液培養(yǎng)；每孔2 mL，每48 h更換1次培養(yǎng)液。

1.5 Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達(dá)檢測 兩組分別繼續(xù)培養(yǎng)1、3、7 d 后收集細(xì)胞，用Trizol 充分裂解細(xì)胞提取總RNA。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30s，共40 個周期。選用Runx2、BMP2、OPN 相應(yīng)引物序列，人β-actin 作為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR法檢測Runx2、BMP2、OPN mRNA表達(dá)。

1.6 Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達(dá)檢測 兩組分別繼續(xù)培養(yǎng)1、3、7 d 后收集細(xì)胞，提取蛋白。SDSPAGE 凝膠電泳：80 V 30 min，120 V 70 min。200 mA 70 min 將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h。TBST 洗膜，一抗孵育4 ℃過夜。第2 日，常溫下二抗孵育2 h。然后PVDF 膜用TBST洗3 次，每次10 min，ECL 曝光。采用Western blotting 法檢測Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達(dá)，GAPDH 作為內(nèi)參。

1.7 ALP染色 兩組細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后棄培養(yǎng)液，4%的多聚甲醛1 mL 固定15 min，加入DDH2O 1 mL，輕柔沖洗3 次。按照BCIP/NBT ALP顯色試劑盒說明書配制ALP 染色劑染色，室溫避光孵育6 h 后，輕輕吸去染色試劑，使用DDH2O 終止顯色反應(yīng)，在40倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 兩組細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后進(jìn)分別用PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定1 min，各組加入DDH2O 1 mL，輕柔沖洗3次。1%茜素紅染液（pH 4.2）染色，37 ℃孵育0.5～1 h，倒掉茜素紅染液，DDH2O加入終止反應(yīng)。在40倍光鏡下觀察成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理分析。計量資料符合正態(tài)分布采用±s表示，組間比較采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBMSC 生長情況 原代hBMSC 接種后約2 h細(xì)胞迅速貼壁、伸展恢復(fù)成梭形，細(xì)胞均勻生長，原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d后即可進(jìn)行傳代，以后平均4～5 d傳代1次，傳至第3代時，細(xì)胞生長良好呈均一梭形，形態(tài)清楚。相差倒置顯微鏡下觀察第3代hBMSC呈長梭形或多角形生長，類似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞體豐滿，細(xì)胞質(zhì)均勻。

2.2 兩組Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達(dá) 兩組成骨誘導(dǎo)1、3、7 d，Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。觀察組隨誘導(dǎo)時間延長，Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達(dá)增加，不同時點Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN mRNA表達(dá)（n=3，±s）

表1 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN mRNA表達(dá)（n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與本組1 d比較，#P＜0.05；與本組3 d比較，&P＜0.05。

2.3 兩組Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達(dá) 兩組成骨誘導(dǎo)1、3、7 d，Runx2、BMP2、OPN蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。觀察組隨誘導(dǎo)時間延長，Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達(dá)增加，不同時點Runx2、BMP2、OPN mRNA 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN 蛋白表達(dá)（n=3，±s）

表2 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN 蛋白表達(dá)（n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與本組1 d比較，#P＜0.05；與本組3 d比較，&P＜0.05。

2.4 兩組ALP染色情況 光學(xué)顯微鏡下觀察可見，觀察組成骨誘導(dǎo)7 d后酶活性細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色塊狀沉淀，顯色較深；，而對照組則顯色較淡。見圖1。

圖1 兩組ALP染色

2.5 兩組茜素紅染色情況 觀察組成骨誘導(dǎo)7d 后其礦化結(jié)節(jié)明顯增多且紅色深染，大小不一，呈團(tuán)塊狀；對照組礦化結(jié)節(jié)少且紅色淺染。見圖2。

圖2 兩組茜素紅染色

3 討論

我們前期的臨床隨訪及動物模型證實骨折合并脾切除會造成骨折延遲愈合，這表明脾切除后免疫功能會受到顯著影響。骨折后在損傷修復(fù)的初始階段，各種炎性相關(guān)的細(xì)胞因子被釋放在損傷部位同時對骨折組織周圍的各類細(xì)胞都有著趨化作用及促進(jìn)增殖、加速修復(fù)的作用。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞以及肌腱、韌帶等多種結(jié)締組織［8-9］。IL-18在人體內(nèi)廣泛分布，在抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［10］。研究顯示IL-18 可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，通過粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）促進(jìn)成骨同時抑制破骨細(xì)胞活性［11］。并且有研究表明骨質(zhì)疏松病人經(jīng)過12 個月抗骨質(zhì)疏松治療后血中IL-18 明顯升高且骨密度增加，此研究表明IL-18對骨質(zhì)疏松患者是一種有益的保護(hù)因子［12］。最近研究顯示，IL-18抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)PTH 骨合成代謝作用尤其明顯［13］。同時有報道表明IL-18 可上調(diào)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中滑膜細(xì)胞破骨形成關(guān)鍵調(diào)控因子RANKL的產(chǎn)生，也促進(jìn)了M-CSF、GM-CSF 及OPN 的生成［14］。本研究結(jié)果顯示，hBMSC 經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d 后鈣化結(jié)節(jié)的茜素紅染色呈橘紅色塊狀和片狀，表明IL-18對鈣化結(jié)節(jié)的形成有明顯促進(jìn)作用，可誘導(dǎo)hBMSC 向成骨細(xì)胞分化。

Runx2 屬于Runx 蛋白家族，能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，同時也是骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)Runx2也是BMP下游的重要調(diào)節(jié)因子，在骨修復(fù)與重建中發(fā)揮重要作用［15］。BMP 作為成骨細(xì)胞生長的啟動因子，可調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)未分化的BMSC不可逆地分化為成骨細(xì)胞，在成骨過程中BMSC 在局部BMP-2的刺激下發(fā)生化學(xué)趨化、聚集后分化形成軟骨和骨［16］，BMP2也可通過不同的Smads通路誘導(dǎo)Runx2 表達(dá)，并可通過調(diào)節(jié)Runx2 等其他成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來影響B(tài)MSC 的成骨分化［17］。OPN是一種調(diào)節(jié)蛋白，可由成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生，參與骨的重建、吸收和礦化。研究顯示OPN 可以明顯促進(jìn)hBMSC 的遷移能力，使hBMSC 聚集到損傷部位參與骨組織修復(fù)［18］。同時OPN 被作為成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一，在發(fā)育成熟的成骨細(xì)胞中、晚期階段表達(dá)，參與骨基質(zhì)的礦化和吸收過程。成骨細(xì)胞成熟最終會形成鈣結(jié)節(jié)，而鈣結(jié)節(jié)的形成是hBMSC 成骨分化的最直接的證據(jù)［19］。本研究顯示，hBMSC 成骨誘導(dǎo)1、3、7 d 后，IL-18 對hBMSC 成骨分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runx2、BMP2、OPN 在轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）和蛋白表達(dá)水平都有顯著影響，且隨著干預(yù)時間延長呈上升趨勢。同時ALP 染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7 d后，觀察組較對照組明顯深染，表明IL-18增強(qiáng)hBMSC 的ALP 活性，增強(qiáng)誘導(dǎo)成骨分化能力。ALP 是反映成骨細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志性酶，ALP 活性越高表明成骨分化能力越強(qiáng)［20］。

總之，IL-18 能明顯誘導(dǎo)hBMSC 的成骨分化作用，進(jìn)一步證明脾臟在骨折愈合過程發(fā)揮重要作用。因此骨折合并脾損傷需手術(shù)治療時術(shù)中應(yīng)盡量保留脾臟，以保證術(shù)后患者免疫功能的穩(wěn)定。但有關(guān)IL-18參與成骨作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。