分子伴侶蛋白介導的革蘭陰性菌耐酸機制研究進展

朱 浩，劉 楠

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京210009）

自然界中微生物生長或工業生產過程中會遇到各種外界環境壓力，如高溫［1］、強酸強堿［2］、高滲［3］及氧化［4］脅迫等。在長期進化過程，微生物已形成了一整套響應外界壓力的應對機制，如細胞膜組分由短鏈飽和脂肪酸向長鏈飽和脂肪酸轉化引起的信號通路變化［5］，生理、生化和F1F0-ATP酶和分子外排泵相關的代謝過程［6］，脫羧和脫氨基［7］等一系列酶促反應等。以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性菌在長期進化過程中利用這一系列生理、代謝過程及質子消耗等機制，抵御外界酸性環境對菌株生長的影響，主要機制包括由HdeA/B分子伴侶介導的周質空間耐酸機制、代謝相關的谷氨酸脫羧酶途徑（acid resistance 3，AR2）和精氨酸脫氨酶途徑（acid resistance 3，AR3）的耐酸機制以及與耐酸基因相關的二元調控系統等。

革蘭陰性菌為雙層膜結構，外層膜上具有非專一性通道蛋白，允許小分子物質進出，其中氫離子可在相關通道蛋白進入周質空間時，對菌體造成酸脅迫，導致周質空間重要代謝相關蛋白質錯誤折疊，影響其表達［8］。在革蘭陰性菌的周質空間中存在與菌體耐酸機制密切相關的分子伴侶，其幫助保護新生蛋白質的折疊以及在酸性環境壓力下失去活性的蛋白質重折疊，使其回復活性［9］。因此，系統研究革蘭陰性菌周質空間中分子伴侶的結構、耐酸機制及調控方式就顯得尤為重要。

1 周質空間及分子伴侶的結構及功能

1.1 革蘭陰性菌周質空間的結構

周質空間（periplasmic space），又稱周質（peri?plasm）或壁膜間隙，是革蘭陰性菌細胞膜與外膜之間的間隔區域。周質空間蛋白主要分為4類：第一類為水解酶類，例如蛋白酶、核酸酶等；第二類為合成酶類，例如肽聚糖合成酶；第三類為結合蛋白，具有運輸營養物質的作用；最后一類為底物蛋白，主要與細胞的趨化性有關［10］。當細胞面臨外界酸性環境壓力時，周質空間蛋白質較胞內蛋白受到酸性壓力更大，所受酸性傷害也比胞內蛋白質更嚴重。在革蘭陰性菌耐酸過程中，除了胞內多種脫羧酶系統外，分子伴侶可識別并保護蛋白質空間結構，使其維持活性狀態，避免沉淀降解，是調控革蘭陰性菌耐酸途徑的重要分子之一。

1.2 革蘭陰性菌的分子伴侶

多數蛋白質是邊翻譯邊折疊過程，需要相關酶以及分子伴侶的參與。細胞中某些蛋白質分子可以識別正在合成的多肽鏈或部分折疊的多肽并將這些蛋白質轉運至相應功能部位，從而幫助多肽轉運、折疊和裝配，這類分子本身并不參與最終產物的形成，被稱為分子伴侶［11］。根據功能分子伴侶主要有熱休克蛋白70（Hsp70）和熱休克蛋白60（Hsp60）兩大家族：Hsp70與部分折疊的蛋白質暴露在外的疏水區有效地結合，防止它們彼此之間聚合在一起［12］；Hsp60則自身形成桶裝結構，沒有折疊的蛋白質可以在其中進行有效的折疊［13］。所有的分子伴侶都具有ATP酶活性從而通過水解ATP有利于克服蛋白質折疊過程中遇到的能障。在大腸埃希菌中，已知主要參與周質空間耐酸反應的分子伴侶為HdeA、HdeB，此外，在一些嗜酸菌如Picrophilusoshimae中，由GroEL、DnaK組成的分子伴侶耐酸體系，同樣可在ATP的協助下發揮其保護周質空間蛋白質的功能［14］。

1.3 革蘭陰性菌的分子伴侶結構

Hsp70是一類從古細菌、植物到人類幾乎所有生物體中均有發現且進化最為保守的熱休克蛋白質。Hsp70由45 kD N-末端核苷酸結合結構域（nucleotide binding domain，NBD）和25 kD的C-末端底物結合結構域（substrate binding domain，SBD）組成［15］。NBD具有結合和水解ATP的功能，由兩個亞結構域（I和II）組成，兩個亞結構域又被進一步分成4個子域（IA、IIA、IB、IIB）。在I和II兩個亞結構域間有裂縫，核苷酸結合位點位于裂縫的底部［16］。不同外界環境的刺激可誘導Hsp70發揮幫助蛋白質正確折疊［17］、保護細胞免受外界環境刺激［18-19］和抗氧化作用［20］等生物學功能。Hsp60存在于所有的原核及真核生物的線粒體和葉綠體中，原核生物中Hsp60的類似物是大腸埃希菌中的伴侶蛋白GroEL，而在真核生物中的線粒體中以Hsp60形式存在，Hsp60在線粒體外區域中以單體或低聚體的形式存在，除扮演分子伴侶功能外，并具有協調細胞凋亡、參與炎癥與免疫反應等功能，與神經系統疾病相關［21-22］。在革蘭陰性菌中，與耐酸密切相關的熱休克蛋白包括屬于Hsp70的HdeA/B、DnaK和屬于Hsp60的GroEL等。

研究表明，HdeA和HdeB是調節細菌細胞在酸性環境下生理活性重要的分子伴侶蛋白。HdeA和HdeB序列相似度較低，但它們的單體結構具有較高的相似性，核心結構均由4個α-螺旋包裹形成疏水區［23］。中性環境下形成同型二聚體，但HdeA與HdeB單體排列組成方式不同。HdeA兩個α-螺旋平行相對，而HdeB呈垂直分布［24］，但兩種二聚體α-螺旋均包裹疏水表面，與周質空間蛋白結合的主要部位，當疏水區表面的氨基酸被取代時，其失去與底物蛋白結合能力［25］。此外，在面對酸性環境壓力的刺激下，GroEL、DnaK也可防止蛋白聚集并修復受損蛋白［26］。

2 分子伴侶介導的耐酸機制

盡管蛋白質的空間結構與其氨基酸序列相關，但細胞在面對外界壓力如高溫、強離子濃度以及強酸堿度等極端環境時，胞內新生肽鏈經常不能正確折疊，傾向于形成非天然狀態下的空間結構，這些異常空間結構會暴露出內部疏水區，發生蛋白質的聚集，影響細胞正常功能，甚至造成細胞死亡。因此，細菌細胞需要利用胞內相關“糾錯”系統，應對外界環境壓力的影響，而針對于酸性環境的壓力的過程中，位于周質空間區域的蛋白質最易受到pH變化的影響，故其空間中分子伴侶這套“糾錯”系統產生了重要的作用，不同的分子伴侶耐酸機制有異同（圖1）。

2.1 HdeA/B分子伴侶

在大腸埃希菌及布氏桿菌Brucella abortus中敲除HdeA/B基因可明顯降低其在酸性環境下存活率，回補HdeA或HdeB基因后，則可增加菌株存活率［27］。HdeA/B主要通過疏水力作用結合底物蛋白，在中性環境下，HdeA與HdeB形成無活性二聚體；當細胞處于強酸環境（pH＜3），HdeA與HdeB可感知細胞外氫離子濃度變化，HdeA/B從無活性的二聚體解離為單體，暴露疏水區域與底物蛋白結合，保護底物蛋白免受酸性環境的的傷害［28］。此外，體外實驗結果顯示：HdeA與HdeB發揮保護蛋白活性的最適pH不同，在pH為2時，HdeA活性高于HdeB，二聚體分離較完全；pH為3時，則HdeB較高，完全解離為單體狀態［29］。

在酸性環境下，周質空間蛋白DegP和SurA是HdeA的主要底物蛋白；在中性環境下，DegP和SurA可幫助受HdeA蛋白保護的底物蛋白重新折疊并恢復其活性，故稱DegP和SurA為保護伴侶蛋白的伴侶蛋白（chaperone-protecting-chaperone），是革蘭陰性菌重要的耐酸機制之一［28］。北京大學陳鵬課題組利用新一代可切割型光交聯探針DiZSeK與熒光差異雙向凝膠電泳（2D-DIGE）相結合，檢測周質空間中與HdeA/B分子伴侶直接作用的底物蛋白，結果顯示在酸性環境下，轉運蛋白、代謝酶、膜蛋白、脂蛋白及蛋白酶等周質空間蛋白質與HdeA/B作用，完整地闡釋了細菌抵御酸脅迫過程中pH對于分子伴侶的底物特異性調控機制，即pH通過系統性地調控HdeA/B及底物蛋白的折疊狀態與功能，使分子伴侶蛋白在不同條件下逐步激活，協同分工保護底物蛋白，并在其釋放后幫助重新折疊［30］。

圖1 分子伴侶耐酸機制

2.2 GroEL分子伴侶

GroEL是一種由14個亞基組成的同型寡聚復合體，呈雙環圓桶狀結構。3個主要功能域：含待折疊蛋白結合位點以及GroES結合位點的頂部結構域、中間結構域以及ATP結合位點的赤道結構域。GroES充當桶頂部的圓蓋，可以和GroEL分開。待折疊肽鏈進入圓筒內部以后，頂蓋合上，肽鏈在內部與桶壁發生多次可逆結合，每一次結合由ATP水解所驅動，在最終折疊成特定的三維結構之前可能會消耗大量的ATP［31-32］。一旦折疊完畢，便從GroES-GroEL復合物中釋放出來。當外界環境遭遇酸脅迫時，由分子伴侶蛋白組成的抗逆體系，可幫助蛋白質正確折疊、組裝、轉運及降解，從而促進細胞自我修復，適應外界環境壓力。研究發現pH的降低可引起At.thiooxidans中ZJJN-3核心的修復分子伴侶GrpE、DnaK、DnaJ轉錄水平上調，從而確保在酸脅迫下蛋白的正確折疊［33］。

研究顯示，革蘭陰性菌可通過不同熱休克基因表達，使其在動態環境中耐受應激環境，尤其是酸性環境［34］。在協助底物蛋白去折疊過程中，GroEL進化出多種機制協助底物蛋白進行去折疊過程，Dahjya等［35］認為GroEL僅促進底物去折疊，但不改變去折疊速率。通過折疊中間體模型發現，底物RCAM-T1被牢牢地結合在GroEL上，使平衡向著去折疊方向進行。但一些蛋白的去折疊過程也可通過GroEL促進其去折疊速率，一旦GroEL參與其去折疊過程，去折疊速率明顯增加［36］。

2.3 DnaK分子伴侶

DnaK是一種ATP依賴的分子伴侶蛋白，可參與酸性環境刺激下大腸埃希菌中蛋白質的保護過程。在細菌中DnaK屬于熱休克蛋白70家族，具有NBD以及SBD兩結構域。ATP存在情況下，DnaK與ATP緊密結合形成單聚體，無ATP時DnaK以無序低聚物存在。DnaK是大腸埃希菌中重要的應激型分子伴侶，其轉錄和蛋白表達水平在酸脅迫的細菌細胞中均會提高。在外界酸性環境刺激下，它可與GroEL分子伴侶相互協作，幫助蛋白質正確折疊以及修復損傷蛋白［37］。Abdullah等［38］在乳酸菌NZ9000中異源表達大腸埃希菌DnaK基因，發現DnaK可以提高其對乳酸的耐受水平，異源表達菌株對于pH等環境壓力較野生型菌株存活率提高4.6倍，GroEL等分子伴侶蛋白表達水平顯著提高［39］。

3 分子伴侶介導耐酸機制的調控方式

微生物在適應外界酸性環境過程中，進化出多種應對機制來回應酸性環境信號。近年來提高微生物酸脅迫的耐受性成為人們研究熱點，主要途徑包括全局調控工程、過表達微生物耐酸相關熱休克蛋白、人工誘變或基因組改組等以提高微生物對酸的耐受性［40］。

3.1 全局調控因子

全局轉錄調控工程（global transcription machinery engineering，gTME）是通過改造和進化全局轉錄因子、轉錄機器等關鍵蛋白，構建高度多樣、復雜的轉錄調控突變文庫，在轉錄水平上產生新型的豐富多樣性，實現對基因表達網絡和細胞代謝重程，并以定向進化方式加以迭代，從而使細胞獲得所期望的表型。針對細胞酸脅迫的復雜性，可利用gTME從轉錄全局角度來調控周質空間伴侶分子的活性而抵耐酸脅迫［41］。H-NS是一種典型的全局調控因子，與轉錄抑制相關的DNA結合蛋白，在大腸埃希菌中主要調節與環境應答相關基因［42-43］。H-NS可自身結合形成二聚體，在大腸埃希菌中過表達H-NS基因后通過轉錄組學手段顯示，H-NS可調控許多耐酸機制基因，導致細菌耐酸能力變化，如HdeA、HdeB、HdeD，這表明H-NS是大腸埃希菌耐酸過程重要的調控因子［44］。Gao等［45］通過易錯PCR等技術，在大腸埃希菌MG1655菌中構建H-NS突變體文庫，獲得在酸性環境下菌株生長能力顯著提高的耐酸菌株，突變型菌株較野生型菌株在酸性環境下生長密度提高24%。進一步通過轉錄組學分析顯示，H-NS突變體可顯著激活AR2途徑以及HdeA和HdeB，從而達到提高大腸埃希菌耐酸能力的目的。

3.2 ABC轉運體

ABC轉運體（ATP-binding cassette transporter）是所有轉運體家族中最大的一類轉運體，廣泛分布于從原核生物到人類幾乎所有的物種中［46］。大部分ABC家族轉運體都是跨膜蛋白，通過偶聯ATP水解釋放的能量來轉移底物。ABC轉運體結構由2個跨膜結構域（transmembrane domain，TM）和2個NBD組成。乳酸乳球菌在工業發酵過程中會大量積累乳酸及其他酸性代謝產物，影響細胞生長及代謝活動，降低發酵產量［47］。Zhu等［48］在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中過表達ABC轉運體的4種基因RbsA、RbsB、MsmK及DppA，結果顯示4組重組菌株酸性環境下生長2 h后較野生型菌株存活率分別提高7.0、10.3、163.3、2.0倍，轉錄組學數據顯示4種重組菌株中耐酸基因的表達較野生型菌株同樣顯著性提高。4種ABC轉運體蛋白的過表達可顯著提高乳酸乳球菌的耐酸性。可見改善細菌酸性環境下耐受程度，有助于高質量發酵產物的生產。

3.3 其他壓力反應調控蛋白

在革蘭陰性菌中還存在調控其他壓力反應的基因，通過調節這些基因的活性也可以改變菌體對酸的耐受。RpoS是一般酸脅迫反應的主要調控因子，可調控特異性耐酸基因的表達，感知氧化應激、高溫、高壓以及酸性環境壓力［49］，酸脅迫過程中，可促進革蘭陰性菌如Shigella flexneri細胞膜組成改變，降低細胞膜流動性，抑制H+的入侵，提高細胞生存能力；GadEWX［50］、RcsB基因［51］會影響AR2途徑中GadA和GadX的表達，在大腸埃希菌Escherichia coli K-12 MG1655中敲除GadEWX基因，通過轉錄組及生長狀況顯示，GadEWX基因的表達與GadA的表達呈正相關，GadEWX的敲除可降低菌株酸性環境下存活率；在肺炎鏈球菌Klebsi ella pneumoniae CG43S3中敲除RcsB可顯著降低酸脅迫下菌株存活率并影響GadA基因的表達；此外RcsB與KvhA基因均可調控HdeB、HdeD和YfdX從而影響細菌細胞內的耐酸能力；大腸埃希菌Escherichia coli K-12中EvgA會通過調控YdeO蛋白活化HdeA及HdeB，提高其耐酸能力［52］；在痢疾桿菌Shigella Flexneri中EvgS/EvgA雙分子信號傳遞系統是一種致病性相關調控基因，參與抗生素抗性基因與耐酸基因的調控，Fur基因可間接調控EvgA，從而影響下游耐酸基因的作用［53］。

中科院天津工業生物技術研究所劉君課題組通過適應性進化策略結合轉錄組測序，在谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 13032中，通過連續70 d的酸性環境刺激進化，篩選得到耐酸菌株。通過比較分析進化菌株與野生型菌株細胞結構、生長曲線、活性氧水平以及轉錄組表達水平，結果顯示適應性進化策略可使得菌株更好保持酸脅迫環境下胞內完整性，維持了更高的胞內pH及較低的活?，性氧水平（較野生型降低61%），酸脅迫下較野生型菌株存活率提高39%，此外，研究中還發現和鑒定出多個候選抗酸元件，如銅伴侶蛋白Cg1328、細胞分裂蛋白FtsE/X、脂肪酸合成酶Fas、分子伴侶HscA等。進一步研究揭示，過氧化氫酶-饑餓誘導DNA保護蛋白（KatA-Dps）介導的胞內活性氧清除過程和硫代謝調控因子（McbR）介導的硫元素同化抑制效應能夠協同參與谷氨酸棒桿菌的低酸脅迫耐受應答，是影響谷氨酸棒桿菌抗酸生理性能的重要因素，有助于更好理解菌株酸脅迫下生理適應策略，為耐酸菌株的開發提供了一種全新的思路［54］。

4 展望

細菌細胞在各種環境壓力下，通過長期進化，形成多種應對機制來應對各種壓力環境。其中酸性環境下細菌細胞的耐酸機制是令人關注的研究方向之一。目前已知多種氨基酸脫羧酶系統（AR2-AR5）、細胞間質空間分子伴侶的作用（HdeA、HdeB），此外還有多種關鍵基因的表達可影響細菌細胞內耐酸機制（H-NS、ABCtransporter、RcsF、RcsC等），這些機制的發現對于無論是工業化發酵過程，還是臨床抗菌治療靶點的發現均具有重要作用，也對蛋白質間相互作用的檢測提供了理論基礎。因此，深入探究和解析分子伴侶對低酸脅迫環境的生理適應策略，以期利用這些知識對目的菌株進行生理性能改造，提高菌株在酸性脅迫環境下的存活能力和耐受性，從而充分發揮其應用價值，具有重要理論和現實指導意義。