馬賽替尼通過抑制自噬和細胞凋亡減輕腦缺血/再灌注損傷

王 燕，平鋒鋒，周丹麗，陳艷華，凌菁菁*

（1南京醫科大學附屬無錫市兒童醫院藥學部，無錫214023；2南京醫科大學附屬無錫市人民醫院生殖醫學科，無錫214023）

腦卒中是一種常見的神經系統疾病，因其具有高發病率、高致殘率和高致死率的特點，對人類健康帶來極大威脅。缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，占腦卒中患者總數的60%～70%。一項世界衛生組織調查報道，我國腦卒中的發病率居于世界首位，且隨著人口老齡化，發病率還在逐年上升［1-2］。因此，研究缺血性腦卒中的發病機制和損傷后的修復機制，尋找能有效改善神經功能，發揮腦保護作用的藥物一直是眾多神經病學科研工作者為之努力的方向。馬賽替尼（masitinib）是一種口服的C-kit抑制劑，C-kit屬于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，其配體為SCF［3-4］。近年來研究發現，SCF在腦缺血/再灌注（I/R）損傷后，發揮重要的神經保護作用［5-6］。但C-kit是否參與缺血性腦卒中的發病機制尚未見報道。因此，本實驗通過線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，灌胃給予不同劑量的馬賽替尼，評估馬賽替尼治療缺血性腦卒中的潛力，并對其作用機制進行初步探討，以期為臨床腦卒中的治療提供有力的實驗依據和新的研究思路。

1材料

1.1 藥品與試劑

馬賽替尼（法國ABScience公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，中國醫藥上海化學試劑公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB Green?PrimeScript?RT-PCR Kit II（SYBR Green，日本TaKaRa公司）。LC3抗體（美國Santa Cruz公司），Beclin-1、IkB-α、P62、p65、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、caspase 8抗體（美國Abcam公司），Bid抗體（美國Proteintech公司），p-IkB-α、cleaved-caspase 3、GAP?DH抗體（美國CST公司），羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物技術股份有限公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

Sartorius BT 125D電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；5804R型臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）；Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（英國Syngene公司）；熒光定量PCR循環儀（美國應用生物系統公司）；2838MCAO栓線（北京沙東生物技術有限公司）。

1.3動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重260～280 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（合格證編號：SYXK（蘇）2017-0015）。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2方法

2.1 動物分組和受試藥的配制

大鼠適應環境7 d后，隨機分成偽手術（Sham）組、I/R模型組、馬賽替尼低劑量組（18.9 mg/kg）、馬賽替尼中劑量組（37.8 mg/kg）、馬賽替尼高劑量組（75.6 mg/kg）、依達拉奉（3 mg/kg）組，每組12只。

馬賽替尼的具體配制方法如下：稱取馬賽替尼7.56 g溶于生理鹽水10 mL中，配制成756 mg/mL的母液。臨用前取母液0.5 mL至生理鹽水50 mL中，稀釋得到7.56 mg/mL的高劑量組母液，則高劑量組的給藥體積V（mL）=（75.6 mg/kg×大鼠體重（kg））/7.56 mg/mL，以此類推，配制好中劑量組和低劑量組的受試藥。大鼠缺血2 h后再灌注時即刻給藥，每天兩次，連續給藥7 d。Sham組和I/R組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水。實驗流程如圖1-A所示。

2.2 MCAO模型的建立

參照Longa法［7］建立大鼠MCAO模型，術前12 h禁食不禁水。大鼠異氟烷麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸部備皮，碘伏消毒。取頸部正中切口，小心分離皮下脂肪和肌肉，右側頸總動脈（com?mon carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotidartery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA）。用微小動脈夾臨時夾閉CCA和ICA，并在CCA遠心端備線勿扎緊。分離ECA主干，鈍性分離出甲狀腺動脈和枕動脈，并電灼切斷；剪斷后將ECA下拉與ICA成一條直線。在距CCA分叉遠端約2 mm處用眼科剪作細小斜向切口，將肝素浸泡過的線栓（直徑0.26 mm）插入，扎緊縫合線，松開ICA動脈夾，慢慢推動線栓進入ICA，使其從ICA入顱動脈支。線栓穿過距ICA和ECA分叉處約2.0 cm有阻力感時，表明線栓已將大腦中動脈堵塞，將備線扎緊并記錄栓塞開始時間。將少量青霉素注射粉針涂于手術傷口，對齊并縫合皮下軟組織和皮膚，栓線尾部留于體外。2 h后緩慢退出線栓至CCA切口處，恢復MCA區血流供應。術中維持大鼠肛溫37℃左右，直至動物蘇醒。Sham組的動物只做鈍性分離，但不插入線栓，其他操作與手術組相同。

2.3 神經功能評分

再灌注7 d后，根據Zea Longa的神經功能缺損5分制標準［7］，對實驗大鼠進行神經行為功能評分。分數越高，損傷越嚴重。剔除造模過程中死亡大鼠，以及取材時發現蛛網膜下腔出血的大鼠。

2.4 大鼠腦組織含水量的測定

再灌注7 d后，異氟烷過量深度麻醉處死大鼠，快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，迅速稱取腦濕重。然后將腦組織置于110℃干燥箱中烘至恒重，稱取腦組織干重。腦組織含水量=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

2.5 大鼠腦組織梗死體積的測定

采用TTC染色法測定腦組織梗死體積。再灌注7 d后，10%水合氯醛過量深度麻醉處死大鼠，快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，即刻放入鼠腦專用切片模具中，按2 mm的規格冠狀切為5片，迅速加入2%TTC染色液，避光置于37℃水浴中保溫20 min，其間每隔7～8分鐘上下面翻動一次。根據切片顏色結束染色過程，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。將切片按層面順序排列整齊并用數碼相機拍攝照片后輸入電腦，使用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件測定大腦健側半腦面積及梗死側正常組織面積。梗死面積百分比（%）=［（梗死面積×2 mm）/（2×健側腦面積×2 mm）］×100。

2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達

再灌注7 d后處死動物，取缺血側腦組織皮質部分，放入預冷的組織裂解液（1∶9），冰浴中進行勻漿，得到的組織勻漿于4℃12 000 r/min離心20 min，取上清液獲得總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入適當量的蛋白上樣緩沖液混勻、離心、變性、上樣。每孔加入上樣蛋白50μg，SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后進行轉膜、封閉。加入一抗后4℃孵育過夜，二抗室溫搖床孵育2 h。采用ECL發光試劑顯色，并經Image J凝膠成像系統進行顯影檢測。涉及到的一抗包括：LC3（1∶500），Beclin-1（1∶2 000），IkB-α（1∶2 000），p-IkB-α（1∶2 000），P62（1∶3 000），p65（1∶2 000），Bcl-2（1∶1 000），Bcl-xl（1∶1 000），Bax（1∶5 000），Bid（1∶5 000），Bad（1∶2 000），caspase 8（1∶2 000），cleaved-caspase 3（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000）；二抗：羊抗兔IgGHRP（1∶5 000）。

2.7 RT-PCR檢測相關基因的表達

稱取各組大鼠腦組織100 mg，加Trizol 1 mL，提取總RNA，定量后取RNA 2μg逆轉為cDNA，用SYBR Green進行擴增，采用的循環為：95℃15 s，60℃1 min，95℃1 min，65℃10 s，共40個循環。采用GAPDH作為每次擴增過程中的內參，引物的序列見表1。

2.8 HE染色和TUNEL染色

制備腦組織石蠟切片，將組織切片經過梯度乙醇常規脫蠟至水，經蘇木精-伊紅（HE）染色、二甲苯透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。此外，依據TUNEL試劑盒說明書操作，光學顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織凋亡神經元并拍照計數。

2.9 統計學處理

采用GraphPad Prism統計軟件包進行數據統計。所有數據采用xˉ±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1 馬賽替尼對I/R模型大鼠神經功能和腦梗死的影響

Sham組無明顯神經功能損傷。I/R損傷后，各組動物表現出不同程度的神經功能障礙，出現強迫體態和對側前肢偏癱，爬行時向偏癱側轉圈、追尾等相應癥狀。如圖1-B所示，與Sham組相比，I/R組大鼠神經功能缺損評分明顯升高（P＜0.001），表明I/R大鼠造模成功；與I/R組相比，馬賽替尼低、中、高劑量組和依達拉奉組大鼠經過治療后，神經功能缺損評分均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），其中馬賽替尼高劑量組效果最突出。

再灌注7 d后，對腦組織進行TTC染色，評估腦梗死的情況。正常腦組織因含有脫氫酶而被染成紅色，梗死腦組織因細胞膜損傷，導致脫氫酶被完全釋放丟失而不被染色。如圖1-C和1-D所示，Sham組大鼠的腦組織均呈紅色，無梗死灶出現；I/R組和馬賽替尼組均出現了不同程度的腦組織梗死。與Sham組相比，I/R組大鼠腦梗死體積明顯增加（P＜0.001）；與I/R組相比，馬賽替尼低、中、高劑量組和依達拉奉組均能夠不同程度的降低腦梗死體積（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），其中馬賽替尼高劑量組的降幅最大。

Figure 1 Effects of masitinib on neurological score and infarction after ischemia/reperfusion(I/R)A:Experimental outline;B:Neurologic deficits were assessed at 7 d after reperfusion(xˉ±s,n=12);C:Infarcted brain regions were visualized using TTCstaining.Representative examples are shown from each treatment group;D:The ratio of corrected infarct area to whole brain area was calculated for thecerebral infarct size(xˉ±s,n=6).(E)Brain edemaweredetected in ischemic cerebral cortex after cerebral I/Rin rats(xˉ±s,n=6)*P＜0.05 vs shamgroup,**P＜0.01,***P＜0.001 vs shamgroup;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

與健側腦組織相比，缺血側腦組織出現明顯水腫（圖1-E）。與Sham組相比，I/R組大鼠的腦水腫程度顯著增加（P＜0.01）。給予不同劑量的馬賽替尼和依達拉奉后，腦水腫程度均得到了不同程度的減輕（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。

3.2 馬賽替尼對I/R模型大鼠腦組織損傷的影響

HE染色結果如圖2-A所示：Sham組大腦皮層神經元基本正常，核居中，未見神經元明顯變性、壞死及炎細胞浸潤等病理學改變。I/R組大腦皮層神經元均出現重度變性、壞死。神經元數目明顯減少，神經元結構模糊、胞體腫脹，尼氏體減少或消失，出現不同程度的核固縮、核溶解。馬賽替尼各劑量組和依達拉奉組均能不同程度的減輕神經元損傷，神經元變性、壞死程度明顯減輕，炎細胞浸潤明顯減少。

TUNEL染色結果如圖2-B所示：I/R損傷可引起大鼠缺血側皮層神經元細胞發生凋亡，表現為TUNEL陽性細胞（棕黃色）數量明顯增加，Sham組大鼠皮層神經元幾乎未見TUNEL陽性細胞。馬賽替尼各劑量組和依達拉奉組均能不同程度的減少TUNEL陽性細胞數量，其中馬賽替尼高劑量組作用最明顯。結果提示馬賽替尼可明顯減少I/R損傷引起的大鼠缺血側皮層神經元細胞凋亡。

Figure2 Effects of masitinib on neuronal injury and apoptosis in ischemic cerebral cortexA:Cerebral sections were stained with hematoxylin and eosin and examined under light microscopeat 7 d after reperfusion;B:Representativemicropho?tographs of TUNEL staining in the ischemic cortex at 7 d after perfusion(Scale bar,20μm)

3.3 馬賽替尼對I/R模型大鼠腦組織中自噬水平的影響

采用Western blot法檢測自噬標記物LC3、Beclin-1和p62的蛋白水平。結果如圖3-A，3-B和3-D所示，I/R組大鼠腦組織中Beclin-1和LC3-I的表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.01），且LC3-I向LC3-II的轉化增多；p62的表達降低（P＜0.01）。與I/R組相比，馬賽替尼中劑量和高劑量組均不同程度地降低了Beclin-1（P＜0.05，P＜0.01）和LC3-I的表達，抑制了LC3-I向LC3-II的轉化（P＜0.01，P＜0.01）；增加了p62的表達（P＜0.01，P＜0.01）。與蛋白表達的變化一致，給予馬賽替尼中劑量和高劑量后，p62的mRNA水平也顯著上調（P＜0.01，P＜0.01）（圖3-E）。

3.4 馬賽替尼對I/R模型大鼠腦組織中NF-κB信號通路的影響

結果如圖4所示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織內NF-κB蛋白和mRNA的表達明顯上調（P＜0.01，P＜0.01）；與I/R組相比，只有馬賽替尼高劑量組顯著抑制了I/R損傷后NF-κB蛋白和mRNA表達的上調（P＜0.01，P＜0.01）。此外，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織內IκBα的表達顯著降低（P＜0.01），而p-IκBα的表達則明顯增加（P＜0.01）。與I/R組相比，不同劑量的馬賽替尼均能不同程度地逆轉I/R損傷后的上述變化，其中高劑量組作用最顯著（P＜0.01，P＜0.01）。

Figure 3 Effects of masitinib on autophagy in ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of LC3,Beclin-1 and p62 protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B-D:Quantitation of the Western blot analysis for LC3,Beclin-1 and p62 compared with GAPDH;E:p62 mRNA expression was normalized to GAPDH level(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

Figure4 Effectsof masitinib on autophagic cell apoptosisin ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of Bcl-2,Bcl-xl,Bax,Bad,Bid,caspase 8 and cleaved caspase 3 protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B:Quantitation of the Western blot analysis for Bcl-2,Bcl-xl,Bax,Bad,Bid,caspase 8 and cleaved caspase3 compared with GAPDH(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

3.5 馬賽替尼對I/R模型大鼠腦組織中凋亡水平的影響

如圖5所示，Western blot結果表明I/R損傷后，Bax、Bid、Bad、caspase 8和cleaved-caspase 3的表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），而Bcl-2和Bcl-xL的表達則明顯降低（P＜0.01，P＜0.01）。與I/R組相比，馬賽替尼高劑量組顯著逆轉了上述所有蛋白的變化（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。

4討論

腦缺血損傷可阻斷腦血流，導致缺血缺氧，進而過度激活氧化應激和炎癥反應，導致神經元細胞死亡［8-9］。馬賽替尼最初被授權用于治療犬肥大細胞瘤［10］。最新研究指出，馬賽替尼能夠作為一種強的化學增敏劑，增加吉西他濱對人類胰腺癌的抗腫瘤作用［11］。然而，馬賽替尼在腦缺血中的作用卻鮮有研究。本研究旨在探討馬賽替尼對大鼠腦I/R損傷的保護作用及其機制。

Figure 5 Effects of Masitinib on NF-κBsignalingpathway in ischemic cerebral cortex after I/RA:Representative Western blots of NF-κB,IκB and p-IκB protein expression in ischemic cerebral cortex after I/R;B-C:Quantitation of the Western blot and PCR analysis for NF-κB;D-E:Quantitation of the Western blot and PCR analysis for IκB;F:Quantitation of the Western blot analysis for p-IκB(xˉ±s,n=3)**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs model group,##P＜0.01 vs model group

本研究結果顯示，I/R損傷可導致嚴重的神經功能障礙，并伴有自噬的激活。給予馬賽替尼治療后，不僅能明顯降低模型組大鼠腦組織的梗死面積和腦含水量，而且能顯著改善神經功能缺損。TUNEL染色結果表明，馬賽替尼能顯著抑制I/R損傷引起的神經元凋亡。

近年來腦缺血后自噬的研究已成為國內外關注的熱點［12-13］。在正常生理條件下，自噬被限制在基本水平范圍內；但是在饑餓以及細胞內外環境變化的刺激下，自噬便被激活［14］。自噬相關蛋白Atg8，即微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3），是自噬體形成的唯一標志物，LC3-I廣泛分布于細胞質中，當自噬發生形成自噬體后，胞漿型的LC3-I可以轉變成存在于自噬體膜上的脂質型LC3-II，超微電鏡下觀察到自噬體是細胞自噬發生的鐵證，自噬體越多，LC3-II/（LC3-I+LC3-II）的比值越高，細胞自噬水平越高，LC3-II的生成是蛋白水平檢測自噬程度的金指標［15］。自噬蛋白p62通過直接與LC3結合選擇性地并入自噬體中，并通過自噬有效降解。p62水平與自噬活動呈負相關［16-17］。自噬另一相關蛋白是Beclin-1，Beclin-1是第一個被報道參與自噬啟動環節的主要蛋白［18-20］。在本研究中，馬賽替尼顯著降低了LC3-II/I比值，下調了Beclin-1的表達，上調了p62的表達，表明馬賽替尼可能通過抑制自噬對I/R損傷起到神經保護作用。

P62還可以通過鋅指結構與調節細胞凋亡的分子開關RIP1結合形成信號復合物。近年來，研究表明p62/RIP1信號復合物可作為支架蛋白激活IKK，降解IκB，激活NF-κB信號通路［21］。NF-κB信號的激活是由κB激酶的上游激酶抑制劑介導的。許多刺激可激活IκB激酶，使IκB磷酸化，導致其泛素化和蛋白酶體降解。隨后，NF-κB進入細胞核，誘導靶基因轉錄。因此，IκB為阻斷NF-κB通路提供了一種可能的途徑。特別是，“超級阻遏物”IκBα是IκB的一種抗降解形式，已被證明能阻斷NF-κB的活性［22］。在本研究中，馬賽替尼能夠顯著降低I/R損傷后NF-κB和p-IκBα的表達；增加IκBα的表達，提示NF-κB信號通路參與了馬賽替尼對腦缺血損傷的保護作用。

自從Beclin-1在自噬過程中被發現以來，Beclin-1作為一種Bcl-2相互作用蛋白的新作用被注意到了［23-24］。Bcl-2或Bcl-xl可與Beclin-1結合以抑制自噬，而Beclin-1的敲除使哺乳動物細胞對饑餓誘導的凋亡敏感［25］。一旦Beclin-1和Bcl-2或Bcl-xl之間的相互作用被破壞，Beclin-1將被釋放以促進自噬［26-27］。先前的研究表明P62在細胞凋亡中起著信號傳導的核心作用［28］。作為對死亡受體刺激的反應，基于Cullin3的泛素連接酶可以與誘導死亡的信號復合物結合并誘導caspase 8的多泛素化。當用誘導內質網應激或蛋白酶體抑制的試劑處理細胞時，細胞可以直接通過caspase 8激活凋亡系統，而不涉及死亡受體信號。Caspase 8介導的細胞凋亡的新機制依賴于自噬相關蛋白LC3和P62［29-31］。因此，caspase 8除了在“經典”外源性凋亡中作為一種典型的caspase物種外，還可以P62依賴的方式激活，并參與一種替代的內源性凋亡途徑，特別是在由各種試劑或藥物誘導時。在本研究中發現馬西替尼可明顯降低缺血再灌注損傷后促凋亡蛋白Bid、Bax、Bad、caspase 8和切割caspase 3的表達，而增加Bcl-2和Bcl-xl的表達。基于以上結果，推測馬賽替尼可下調Beclin1和caspase 8的表達，推測馬賽替尼可能通過P62依賴的方式阻止Bcl-2與Beclin-1的分離，抑制capase 8的激活，從而抑制自噬和凋亡。

綜上所述，馬賽替尼減輕了缺血再灌注的神經損傷作用，其作用機制可能是通過抑制過度自噬和凋亡發揮的。自噬參與了腦血管疾病的發生過程這一點毋庸置疑，但自噬在腦缺血損傷后的作用仍然是有爭議的。有的研究報道自噬在缺血/低氧性腦病發病機制中加重腦損傷，但也有報道在腦缺血后，自噬的激活減輕腦損傷，起到腦保護作用。關于自噬在缺血性腦損傷中呈現的相反作用，一方面推測這可能與實驗中采用了不同的缺血再灌注時間、使用了非特異性的藥物或者方法有關；另一方面也進一步提示自噬在腦缺血的病理生理機制中是一把“雙刃劍”。選擇合適的藥物，引導自噬在疾病中發揮積極作用，這將為腦血管疾病的治療開啟新紀元。