VEGF-A及PI3K/AKT通路在結直腸癌中的表達及臨床意義

徐潤強 劉宇平 張海良 劉海盛 劉鈺君 姚金科

【摘要】 目的：研究血管內皮生長因子（VEGF）-A及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路在結直腸癌中的表達及臨床意義。方法：選取2013年9月-2015年9月本院收治的結直腸癌患者80例作為觀察組，同時切取患者癌旁正常腸黏膜組織作為對照組。分別采用免疫組化法檢測癌組織和癌旁組織VEGF-A、PI3K及AKT表達水平，統(tǒng)計比較兩組三指標表達陽性率。單因素分析結直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達水平與患者臨床病理資料的相關性，同時Spearman相關性分析VEGF-A與PI3K及AKT表達相關性。術后隨訪5年，比較VEGF-A、PI3K及AKT陽性和陰性表達患者生存率。結果：觀察組VEGF-A、PI3K及AKT表達陽性率均明顯高于對照組（P<0.05）。結直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;結直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結直腸癌組織中VEGF-A表達與PI3K、AKT表達均呈明顯正相關（rs=0.625、0.517，P=0.001）。結直腸癌中VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者5年生存率均明顯低于陰性表達患者（P<0.05）。結論：結直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表達現(xiàn)象，與腫瘤分期、淋巴結轉移、分化及浸潤深度呈明顯相關性，且患者生存期更短，可能參與結直腸癌病情發(fā)生發(fā)展，對臨床診斷及治療具有重要意義。

【關鍵詞】 VEGF-A PI3K/AKT通路 結直腸癌 表達 臨床意義

[Abstract] Objective： To study the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor （VEGF） -A and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） /protein kinase B （AKT） pathway in colorectal cancer. Method： From September 2013 to September 2015， 80 patients with colorectal cancer were selected as the observation group， at the same time the normal intestinal mucosal tissue was cut off as the control group. The VEGF-A， PI3K and AKT expression levels of cancer tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry， the positive expression rate of three indexes in two groups were counted and compared. Univariate analysis of the correlation between VEGF-A， PI3K and AKT expression in colorectal cancer and clinicopathological data， the correlation of VEGF-A with PI3K and Akt expression was by Spearman correlation analysis. The patients were followed up for 5 years， the survival rate of VEGF-A， PI3K and AKT positive and negative expression patients were compared. Result： The positive rate of VEGF-A， PI3K and AKT expression in the observation group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. There were no significant differences in sex， age， tumor diameter and tumor site of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and AKT positive expression patients （P>0.05）; there were significant differences in stage， differentiation degree， lymph node metastasis and invasion depth of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and positive expression patients （P>0.05）. There were significant positive correlation between VEGF-A expression and PI3K， AKT expression in colorectal cancer （rs=0.625， 0.517， P=0.001）. The survival rate of colorectal cancer VEGF-A and PI3K and AKT positive expression patients were significantly lower than those of negative expression patients （P<0.05）. Conclusion： VEGF-A， PI3K and AKT in colorectal cancer tissues are highly expressed， and shows significant correlation with tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and depth of invasion， it also reduces survival， may be involved in the development of colorectal cancer， it is of great significance for clinical diagnosis and treatment.

[Key words] VEGF-A PI3K/AKT pathway Colorectal cancer Expression Clinical significance

First-authors address： Zengcheng District Peoples Hospital of Guangzhou City， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.001

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是指大腸上皮內起源的腫瘤，其發(fā)病病因尚未明確定論，可能與大腸息肉、炎性疾病、生活飲食及遺傳等諸多因素有關，在我國具有較高的發(fā)病率和致死率，分別高居所有惡性腫瘤的第3位和第5位，且發(fā)病率有逐年升高趨勢[1]。結直腸癌早期常無特異性癥狀，隨著病情進展可出現(xiàn)排便習慣改變、腹瀉便秘、便血及腹痛等癥狀，多數(shù)患者早期很難及時診斷，加之此腫瘤惡性程度較高，出現(xiàn)淋巴結或血行轉移時間較早，造成其病死率常年居高不下。研究指出，雖目前手術、放化療、靶向治療等手段不斷改進，結直腸癌患者五年生存率仍僅約40.0%，整體預后質量仍不滿意，因此了解其發(fā)病機制以提高早期診治效率，已成為臨床醫(yī)師需重點解決的目標[2]。伴隨結直腸癌分子生物學機制研究深入，多種基因、酶類及信號通路在其發(fā)生發(fā)展中受到高度關注。血管內皮生長因子（VEGF）-A是一種具有高活性的功能性糖蛋白，具有誘導腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移、新血管生成及通透性增加等功能，已被證實為多種惡性腫瘤的正向調節(jié)因子[3]。研究指出，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路與細胞增殖、凋亡密切相關，其異常活化后對細胞凋亡抑制明顯，而加速細胞增殖、分化及轉移速度，并可促進腫瘤新血管生成，促進腫瘤轉移侵襲[4]。目前VEGF-A與PI3K/AKT通路在結直腸癌中研究相對較少，而研究其對結直腸癌發(fā)生發(fā)展影響，對腫瘤早期診斷、藥物治療靶點開發(fā)及預后監(jiān)測等具有重要意義。因此本研究筆者就基于此課題展開保證，旨在為臨床提供指導，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年9月-2015年9月廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院收治的結直腸癌根治術患者

80例為觀察組。納入標準：均符合結直腸癌相關診斷標準[5]，且經(jīng)術后病理學診斷證實;均接受手術治療且術前無放化療、靶向治療等治療史。排除標準：合并嚴心腦血管、肝腎肺等實質性臟器組織疾病;合并胃癌、肝癌等其他類型惡性腫瘤;合并HIV等嚴重免疫系統(tǒng)疾病;臨床病理資料不完整或標本欠理想。同時切取患者癌旁正常腸黏膜組織（距離腫瘤≥5 cm）作為對照組。80例患者，男45例，女35例;年齡20～87歲，平均（56.28±11.31）歲，腫瘤部位：結腸49例，直腸31例。本研究經(jīng)院內倫理委員會審核批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 免疫組化法檢測：80例結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織4%中性緩沖甲醛固定，常規(guī)制作石蠟包埋組織，石蠟組織5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟至水，抗原修復自然冷卻后在醫(yī)用雙氧水下浸泡10 min，滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水充分洗凈，置于PBS中浸泡5 min，分別滴加VEGF-A（abcam編號ab1316）及PI3K（abcam編號ab140307）及AKT抗體（abcam編號ab8805），隨后置于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后滴加免疫顯色試劑（丹麥DaKO，批號20077835B），室溫環(huán)境孵育20 min，PBS漂洗后滴加以DAB顯色，顯微鏡下控色，依次蘇木素復染、脫水、透明及封片，高年資病理醫(yī)師于顯微鏡下觀察結果。結果判讀：采用雙盲法進行讀片，癌細胞出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細胞，未出現(xiàn)則為陰性細胞，采用染色程度與染色細胞比例評分之和作為陽性標準，其中染色程度：無染色（0分）、淡黃色（1分）、黃色（2分）及棕黃色（3分），陽性細胞比例：≤5.0%（0分）、6.0%～10.0%（1分）、11.0%～20.0%（2分）、21.0%～50.0%（3分）及>50.0%（4分），兩項得分相乘，總得分≤2分為陰性表達、3～4分為弱陽性表達（+），6～8分為中等強度陽性表達（++），9～12分為中等強度陽性表達（+++）[6]。將中等強度以上表達定義為本研究的陽性表達病例，不表達或弱陽性定義為本研究的陰性表達病例，計算陽性率。

1.3 觀察指標 比較兩組標本組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達陽性率;單因素分析結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移等臨床病理資料相關性;所有病例隨訪時間截止為2020年10月1日，比較結直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性和陰性表達患者5年生存率，并繪制生存曲線。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。并采用單因素分析各指標相關性，相關性分析采用Spearman法，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法比較，并繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組標本組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達陽性率比較 VEGF-A、PI3K及AKT在觀察組結直腸癌組織中大部分呈中等和強陽性表達（圖1），對照組中的癌旁正常腸黏膜大部分為陰性表達或弱陽性表達，無強陽性表達。觀察組VEGF-A、PI3K及AKT表達陽性率均明顯高于對照組（P<0.05），見表1。

2.2 VEGF-A、PI3K及AKT表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 結直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;結直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 VEGF-A表達與PI3K、AKT表達的相關性分析 Spearman相關性分析顯示，結直腸癌組織中VEGF-A表達與PI3K、AKT表達均呈顯著正相關（rs=0.625、0.517，P=0.001、0.001）。

2.4 結直腸癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT表達情況患者5年生存率比較 術后隨訪5年，結直腸癌患者中，VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者5年生存例數(shù)分別為21、24、23例，5年生存率分別為36.21%、38.09%、38.33%，陰性表達患者5年生存例數(shù)分別為17、14、15例，5年生存率分別為77.27%、82.35%、75.00%，結直腸癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者5年生存率均明顯低于陰性表達患者（字2=9.36、7.43、6.67，P<0.05），見圖2。

3 討論

研究指出，結直腸癌發(fā)病受多種因素影響，包括不良生活飲食習慣、遺傳易感性及腸道良性病變等因素，發(fā)病機制較為復雜，涉及多因素、多因子、多步驟及多階段參與，其中癌基因激活與抑癌基因抑制其重要作用[7]。目前，結直腸癌可采用手術、放化療及靶向治療等措施，但其病情整體緩解率偏低，仍具有較高的疾病復發(fā)率，總體治療有效率不足35.0%[8]，因此深入研究結直腸癌發(fā)病分子生物學機制，可對早期診斷、治療及藥物研發(fā)提供重要指導。VEGF是一種高度特異性促血管內皮生長因子，具有促進血管內皮細胞增殖、遷移及新血管生成和通透性增加等作用，基礎研究證實[9]，VEGF在癌細胞對血管內皮細胞侵襲和黏附過程中發(fā)揮重要作用，包括促進癌細胞入血轉移和提高癌組織血流灌注，導致癌細胞活性增強和轉移侵襲，最終造成病情發(fā)展惡化。VEGF-A是屬于VEGF家族成員之一，多由炎性浸潤細胞和腫瘤細胞分泌，正常機體內幾乎無表達，但高表達于腫瘤等血供豐富和代謝旺盛組織，屬于強效促腫瘤細胞和血管生長因子[10]。VEGF-A基因位于第6號染色體6p12位置，其中VEGF-A在新血管生成量多的組織表達較高，包括胎盤、幾乎所有腫瘤、炎性疾病及缺血性心臟病等。實驗研究表明，VEGF-A能改變樹突狀細胞功能，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞攻擊，并可促進腫瘤新血管生成，此外還可能誘導血管內皮生長因子受體（VEGFR）-2表達，促進淋巴管形成及腫瘤細胞淋巴轉移[11]。最新有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A在腸癌中多呈現(xiàn)高表達，可促進腫瘤組織新血管生成和通透性增加，參與癌細胞增殖和侵襲擴散。朱凱旋等[12]研究指出，VEGF-A在結直腸癌組織中高表達，并在淋巴結轉移和TNM高分期患者中表達更高，參與患者病情發(fā)展及轉移侵襲。本研究結果顯示，癌組織中VEGF-A表達陽性率明顯高于癌旁組織，且與結直腸癌患者的TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及浸潤深度密切相關，提示VEGF-A異常高表達參與結直腸癌患者病情發(fā)生進展。

PI3K/AKT信號通路是體內重要的調控通路，正常情況下參與多種細胞基本功能，包括細胞生長增殖、凋亡、代謝及轉錄翻譯等，但該通路異常活化后可抑制細胞凋亡，促進細胞增殖、侵襲轉移和新血管生成，參與多種癌癥、糖尿病等發(fā)生發(fā)展[13]。近年來，結直腸癌患者PI3K/AKT信號通路異常活化研究較多，已被證實其具有促進癌細胞增殖、侵襲轉移及腫瘤血管生成，以及抑制癌細胞凋亡和調控癌細胞增殖周期等多種功能。Waniczek等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路異常活化后AKT可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向癌細胞傳達生存信號，并能抑制不依賴p53途徑的細胞凋亡。有研究指出，肝細胞生長因子（HGF）可經(jīng)PI3K/AKT通路促進VEGF表達，當PI3K/AKT通路異常活化后，導致VEGF高表達，并能經(jīng)NF-κB和β-catenin表達，最終誘導結直腸癌血管形成和轉移[15]。結直腸癌實驗研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路異常活化可誘導細胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依賴性激酶（CDKs）高表達，抑制p27KIP1等基因表達，縮短細胞周期G1期時間，促進細胞分裂增殖，同時還能上調基質金屬蛋白酶（MMP），降解腫瘤細胞外基質，增強癌細胞侵襲和轉移能力，參與結直腸癌病情發(fā)生發(fā)展[16]。但也有研究指出，PI3K/AKT信號通路異常活化僅為結直腸癌發(fā)病的早期事件，早期PI3K、AKT蛋白表達即處于高水平，與病情進展和預后無明顯關系[17-18]。本研究結果顯示，結直腸癌組織PI3K和AKT表達陽性率明顯高于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期、分化越低、淋巴結存在轉移及浸潤深度越深患者的PI3K和AKT表達陽性率明顯更高，且術后隨訪5年，結直腸癌中VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達患者5年生存率均明顯低于陰性表達患者（P<0.05）。PI3K/AKT信號通路不僅參與結直腸癌發(fā)病，且對病情發(fā)生發(fā)展和預后起著重要作用[19]。且本研究結果顯示，結直腸癌組織中VEGF-A表達與PI3K和AKT均呈明顯正相關。VEGF-A與PI3K/AKT通路可能在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到協(xié)同效應[20]。

綜上所述，結直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表達現(xiàn)象，且與腫瘤分期、淋巴結轉移、分化程度及浸潤深度呈現(xiàn)明顯相關性，且患者生存期更短，三者在結直腸癌中高表達具有密切相關性，可能參與結直腸癌病情發(fā)生發(fā)展，對臨床診斷及治療具有重要意義。

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（收稿日期：2020-11-13） （本文編輯：程旭然）