不同種類麥芽對下面發酵啤酒釀造風味的影響

孫可澄，趙鑫銳，2，3，顧千輝，謝婷婷，李江華，2，3，堵國成，2，3，5*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫 214122；4.三只松鼠股份有限公司，安徽 蕪湖 241000；5.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

啤酒與黃酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒，其生命周期已經延續數千年[1]。隨著啤酒工業的發展，現代啤酒因釀造工藝及生產菌株的差異，主要分為Ale啤酒（上面發酵啤酒）和Lager啤酒（下面發酵啤酒）[2]。與Ale啤酒相比，Lager啤酒的發酵溫度較低、周期較長；不僅具有綿密豐富的氣泡和清爽純凈的風味；而且酒體品質更均一、工業生產成本更低[3]。因此，Lager啤酒以其淡爽的風味和穩定的品質深受消費者的青睞，逐步替代Ale啤酒成為現代工業啤酒的主流產品[4]。啤酒中常見的揮發性風味化合物包括醇類、酯類、醛類、酮類、酸類等，其成分和含量不僅決定了啤酒的風味，一定程度上也影響了啤酒的品質[5]。近年來隨著消費者對啤酒品質和風味的要求越來越高，如何保持和改善啤酒的風味，成為諸多生產企業普遍關注的焦點[6]。

大麥是釀造啤酒的主要原料。大麥芽作為“啤酒的骨架”，其品質缺陷會直接造成糖化、過濾的異常，降低生產效率，增加產品成本[7]。因此，麥芽的成分和質量關乎啤酒風味和品質。同時，近年來伴隨著中國啤酒產量的顯著增加，原產大麥的品質和產量卻逐年降低，加劇了國內啤酒行業對高品質原料的需求[8]。而關于麥芽對啤酒品質影響的研究，目前主要集中在β-葡聚糖[9]、蛋白質[10]等成分的分析和浸麥度、發芽溫度等制麥工藝的優化[11]等方面，關于釀造原料的比較和選擇相對較少。

為從源頭監控啤酒生產，通過實驗室啤酒模擬體系，探究3種不同種類麥芽的品質及其對啤酒質量和釀造風味的影響。通過測定多種麥芽的浸出率、α-氨基酸態氮、糖化力、庫爾巴哈值等品質指標及所釀啤酒的酒精度、原麥汁濃度等理化指標，并采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析其香氣成分的差異性，最終選出適合啤酒發酵的麥芽品種，以期釀造出高品質的Lager啤酒，為其工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Lager 497：本實驗室保藏。

1.1.2 化學試劑

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；無水葡萄糖、碘、碘化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；3-庚酮（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；英國麥芽（Eng）、加拿大麥芽（Can）、德國麥芽（Ger）、捷克SAAZ酒花：進口市售。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，無水葡萄糖20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

麥汁培養基：自制麥汁，105 ℃滅菌10 min。

1.2 儀器與設備

DLEUW22050麥芽粉碎機：瑞士Buhler-Miag公司；BGT-8A協定糖化儀：杭州博日科技股份有限公司；Trace1310-ISQ LT氣相色譜質譜聯用儀、TG-WAXMS A色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、TriPlus RSH自動頂空進樣器、固相微萃取纖維頭（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS）：美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗室Lager啤酒發酵模擬體系的建立

稱量并粉碎適量麥芽，加水糖化，趁熱過濾糖化醪。煮沸60 min，期間添加適量啤酒花。二次過濾，調節麥汁濃度，獲得澄清麥汁。分裝、滅菌備用。將酵母活化擴培后接入無菌麥汁培養基，靜置發酵數天。

糖化：45 ℃時，將麥芽粉粒與水按1∶5（g∶mL）混合均勻，置于BGT-8A協定糖化儀。隨后，升溫至48 ℃，保溫30 min；15 min內升溫至63 ℃，保溫40 min；快速升溫至72 ℃，保溫20 min；待碘液檢驗反應液呈黃色，糖化基本接近終點。升溫至78℃，保溫10 min徹底糖化。趁熱過濾糖化醪，獲得“頭號麥汁”；再用適量78 ℃熱水洗滌濾紙，獲得“二濾麥汁”[12]。

煮沸：煮沸60 min，分批添加酒花（0.25‰）。趁熱過濾，阿貝折光儀測定麥汁濃度并調至12°P，獲得澄清麥汁。105 ℃滅菌10 min，冷卻分裝。

酵母活化擴培：挑取單菌落接入1 mL麥汁培養基中，25 ℃，220 r/min培養12 h；將上述菌液轉接入9 mL麥汁培養基中，20 ℃、220 r/min培養12 h；再將上述10 mL菌液轉接入90 mL麥汁培養基中，15 ℃、220 r/min培養12 h。靜置，取酵泥接種于麥汁培養基（1×106CFU/mL）。搖勻后扣上發酵栓，無菌水密封[13]。

實驗室模擬發酵：12 ℃靜置培養8 d。當發酵液糖度為4°Bx左右時，前酵結束。4 ℃靜置發酵7 d，至酒體中無明顯雙乙酰氣味時，發酵成熟，后酵結束[14]。

1.3.2 麥芽品質指標檢測方法

取適量麥芽，依據輕工行業標準QB/T 1686—2008《啤酒麥芽》中分析方法進行浸出率、α-氨基酸態氮、糖化力和庫爾巴哈值（又稱庫值）等麥芽品質指標的測定。

1.3.3 啤酒理化指標檢測方法

后酵結束時取樣檢測，依據國標GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進行酒精度、原麥汁濃度等啤酒理化指標的測定。

1.3.4 啤酒風味物質氣相色譜-質譜檢測方法

（1）色譜條件

氣相色譜條件：TG-WAXMS A色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序為40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至180 ℃，繼續以20 ℃/min升溫至230 ℃，保持15 min。汽化室溫度250 ℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.99%），載氣流量1.0 mL/min，不分流進樣，溶劑延遲時間1 min。質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發射電流34.6 μA，接口溫度280 ℃，質量掃描范圍29～500 amu。

（2）樣品制備

取7.5 mL啤酒樣品于20 mL頂空進樣瓶中，加入0.5 mL的3-庚酮內標溶液（0.3 mg/L），加密封墊、鋁蓋壓緊。將固相微萃取手柄插入頂空瓶，伸出萃取頭。60 ℃水浴保溫，頂空吸附40 min；退回萃取頭，插入GC進樣口解吸5 min[15]。

（3）定性定量分析

通過GC-MS分析檢測得出啤酒風味物質的總離子流圖，采用美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NIST）2014標準質譜庫檢索，結合保留指數（retention index，RI）對發酵液中的揮發性風味成分進行定性，采用峰面積歸一化法進行定量分析[16]。

2 結果與分析

2.1 不同種類麥芽的主要品質指標

2.1.1 不同種類麥芽的庫值

啤酒麥芽的庫爾巴哈值主要反映了制麥過程中麥芽蛋白質的溶解程度，保持在40%～45%為佳[17-18]。三種不同種類的麥芽中，麥芽Can和Ger的庫值適中，分別為45%和40%；而麥芽Eng的庫值含量偏高（50%），三者間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同種類麥芽的庫爾巴哈值Fig.1 Kolbach indexes of different types of malts

2.1.2 不同種類麥芽的糖化力

糖化力又稱淀粉糖化酶活性，淀粉酶活性越大，糖化力值越高，麥芽質量越好[19]。麥芽糖化力是以100 g無水麥芽在20 ℃，pH 4.3條件下分解可溶性淀粉30 min產生1 g麥芽糖為一個唯科（WK）糖化力單位。依據QB/T 1686—2008《啤酒麥芽》中的分析方法，3種麥芽樣品的糖化力分別為357 WK、414 WK和392 WK，均顯著高于優級標準（＞260 WK），三者無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同種類麥芽的糖化力Fig.2 Saccharifying power of different types of malts

2.1.3 不同種類麥芽的浸出率及α-氨基酸態氮

麥芽浸出率一定程度上反映了大麥籽粒發芽過程中干物質的損耗。依據QB/T 1686—2008《啤酒麥芽》的分析方法，不同種類麥芽的浸出率測定結果見圖3。由圖3可知，麥芽Ger的浸出率（以干基計）≥79%，屬優級淡色麥芽；麥芽Can的浸出率（以干基計）≥77%，屬一級；麥芽Eng的浸出率（以干基計）≥75%，屬二級。

圖3 不同種類麥芽的浸出率及α-氨基酸態氮含量Fig.3 Extract rate and α-amino acid nitrogen contents of different types of malts

α-氨基酸態氮反映了麥芽中蛋白質的分解程度及蛋白酶活性，決定了制麥過程中啤酒的品質和風味。一般工業生產要求發芽過程中麥汁α-氨基酸態氮的含量應＞160 mg/L，控制在180～220 mg/L左右為宜。由圖3可知，不同種類的麥芽樣品中，除麥芽Ger的α-氨基酸態氮含量較為適中（186 mg/L），麥芽Eng和Can的α-氨基酸態氮含量均偏低，分別為125 mg/L和118 mg/L。

2.2 麥芽種類對啤酒發酵液理化指標的影響

2.2.1 麥芽種類對啤酒發酵液酒精度及原麥汁濃度的影響

比較3種不同種類麥芽釀造的啤酒酒精度及原麥汁濃度，結果見圖4。

圖4 麥芽種類對Lager啤酒酒精度及原麥汁濃度的影響Fig.4 Effect of different types of malts on alcohol content and original wort concentration of Lager beer

啤酒釀造過程中，酵母吸收代謝麥汁中的多種可發酵性糖，最終生成乙醇和CO2[20]。由圖4可知，3種麥芽發酵制得的啤酒中，Can麥芽的產酒能力最佳，酒精度達2.97%vol；Eng麥芽次之，酒精度為2.91%vol；酒樣Ger的酒精度顯著低于Eng和Can酒樣的酒精度（2.19%vol）（P＜0.05）。

原麥汁濃度指原麥汁中浸出物的百分含量，啤酒的酒精度越高，原麥汁濃度也越高[21]。由圖4可知，酒樣Ger的原麥汁濃度偏低（7.56°P），穩定性差，保存期較短；酒樣Eng和Can的原麥汁濃度適中（分別為8.55°P和8.63°P），酒體口感濃郁，品質也較好。

2.2.2 麥芽種類對啤酒發酵液濃度及發酵度的影響

啤酒濃度指成品啤酒或發酵液中所含浸出物（糖分、氨基酸及其他可溶性有機物、無機物）的質量百分數，包括外觀濃度和實際濃度[22]。其中，外觀濃度是指用糖度計直接測定發酵液或啤酒中的濃度，而實際濃度為發酵液蒸餾出酒精后再次測定的濃度。

發酵度是指酵母消耗原麥汁浸出物的所占百分比，作為判斷發酵是否異常的重要指標，可分為外觀發酵度和真正發酵度。簡單來說，采用外觀濃度計算所得為外觀發酵度，而用實際濃度計算所得為實際發酵度（又稱真正發酵度）[23]。一般情況下，外觀發酵度高于實際發酵度。比較3種不同種類麥芽釀造的啤酒濃度及發酵度，結果見圖5。

圖5 麥芽種類對Lager啤酒濃度（A）及發酵度（B）的影響Fig.5 Effect of different types of malts on the concentration (A) and fermentation degree (B) of Lager beer

由圖5A可知，3種麥芽釀造的啤酒中，酒樣Ger的實際濃度（3.22%）最高，與酒樣Eng和Can均存在顯著性差異（P＜0.05），酒樣Eng和Can無顯著性差異（P＞0.05）。3種麥芽釀造的啤酒中，酒樣Ger的外觀濃度（1.64%）最高，與酒樣Eng無顯著性差異（P＞0.05）；酒樣Can的外觀濃度最低，與其余酒樣存在顯著性差異（P＜0.05）。相較Eng啤酒和Ger啤酒，Can啤酒中浸出物含量偏低，口感更清爽不甜膩。

由圖5B可知，3種麥芽所釀造啤酒中，酒樣Eng和Can的實際發酵度相對較高，分別為67.21%和67.97%，二者無顯著性差異（P＞0.05）；酒樣Ger的實際發酵度最低（57.44%），與其余酒樣均存在顯著性差異（P＜0.05）。3種麥芽所釀造啤酒中，酒樣Can的外觀發酵度最高（86.41%），酒樣Eng次之（81.21%），酒樣Ger最低（78.30%），彼此間均存在顯著性差異（P＜0.05）。結果表明，相較Eng麥芽和Ger麥芽，酵母對Can麥芽所制備麥汁中浸出物的利用率較高，利于酵母的生長和乙醇的生成，該現象與上述酒精度的結果一致。

2.3 麥芽種類對啤酒發酵液風味物質的影響

香氣成分是評判啤酒品質優劣的關鍵因素。本試驗對3種不同種類麥芽發酵的啤酒樣品進行GC-MS分析，酒樣的香味物質對比結果見表1。

表1 不同種類麥芽釀造啤酒的香氣成分含量Table 1 Aroma components content of beer fermented by different types of malts

續表

續表

由表1可知，3種酒樣中的揮發性香氣物質成分種類大致相似，共測出82種香氣物質，分別為酯類35種、醇類24種、酸類9種、醛類7種、酮類7種。其中，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中分別共檢出71、75、73種香氣物質，揮發性香氣成分總相對含量分別為150.17%、271.82%和195.31%。

2.3.1 醇類物質分析比較

3種啤酒共檢測出24種醇類物質。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒均檢出22種醇類物質，其中共有的醇類為20種；總醇相對含量分別為62.59%、102.91%和77.88%，占對應酒樣風味物質總量的41.68%、37.86%和39.88%。其中，主要的醇類物質包括苯乙醇、異戊醇、乙醇、異丁醇等。醇類主要來自于發酵過程中酵母的代謝、其次也來源于糖苷類前體和酯類分解等[24]。不同種類麥芽的發酵結果顯示，3種酒樣中苯乙醇、異戊醇含量最多，二者的含量占總醇類含量的82.97%～91.16%。

作為啤酒中高級醇的重要成分，苯乙醇和異戊醇賦予酒類具有豐滿的香味和口味，并增加酒的協調性，構成了酒體的主要香氣。苯乙醇主要由苯丙氨酸在轉氨酶、脫羧酶和脫氫酶的作用下經過艾氏途徑合成[25]，其來源于麥皮，而非胚乳及整個大麥[26]。三種酒樣中，酒樣Can中苯乙醇相對含量最高（46.37%），酒樣Ger次之（41.07%），酒樣Eng最低（35.16%）。高濃度的異丁醇賦予酒體強烈的刺激味[27]，相較其他酒樣，Eng酒樣中異丁醇的相對含量最低，對啤酒風味影響較小。高級醇是某些酯類物質的前體物質，增加了啤酒后發酵時期形成的酯類種類，對呈香有重要作用，能夠提高酒的感官品質[28]。Can酒樣的總醇類物質相對含量豐富，加拿大麥芽更適合發酵較高酒度的啤酒。

2.3.2 酯類物質分析比較

適量的揮發性酯類化合物不僅益于啤酒的風味和香氣協調性，對啤酒中的老化物質也具有一定的掩蔽效應[29]。3種酒樣中共檢測出35種酯類物質，主要為辛酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯等。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分別共檢出30、34和30種酯類物質，其中共有的酯類有26種；總酯類物質的相對含量分別為42.57%、84.11%和37.89%，占對應酒樣風味物質總量的28.35%、30.94%和19.40%。

揮發性酯是啤酒中的重要風味物質，也是啤酒香氣的主要載體[30]。適量的酯類賦予啤酒花、果香氣，使風味濃郁諧調[31]。其中辛酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯等是成品啤酒中典型的酯類物質[32]。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中，辛酸乙酯的相對濃度最高，分別占總酯的48.48%、41.04%和34.34%，賦予酒體清甜的茴香味。同時，具有曲香、菠蘿香的正己酸乙酯、香甜的乙酸乙酯和具有香蕉香氣的乙酸異戊酯相對含量也很高，使酒香更濃郁[33]。

其中Can酒樣中的總酯類物質含量最多，種類最全；同時含有相對濃度較高的乙酸苯乙酯，具有蘋果、桃子的果香及威士忌的香韻，可以適當緩解苯乙醇給啤酒帶來的悶香感。

醇類和酯類是啤酒香氣物質中最主要的組成部分。啤酒中高級醇含量過高或組分失衡，易引起頭痛等癥狀；而酯類可以有效緩解頭痛，因而醇酯比是評價啤酒風味特點的重要依據[34]。一般醇酯比在3～4較理想，但目前多數啤酒呈偏低趨勢[35]。

3種酒樣的醇酯比結果見表2。由表2可知，其中Ger酒樣的醇酯比最高，在2～3之間，其余酒樣的醇酯比均在1～2之間。由此可見，不同種類麥芽發酵啤酒的醇酯比還是有較大差異的。

表2 麥芽種類對醇酯比的影響Table 2 Effect of different types of malts on the ratio of alcohols to esters

2.3.3 醛類物質分析比較

醛類是啤酒中的主要羰基化合物。新鮮啤酒中的醛類化合物主要形成于麥汁或釀造過程，而隨著儲藏期的延長，老化醛類化合物的含量逐步增加，最終引起啤酒風味穩定性變差[36]。3種酒樣中，共檢測出苯甲醛（苦杏仁、櫻桃及堅果香）、乙醛（青草味）等7種醛類物質。Eng啤酒、Can啤酒、Ger啤酒中分別共檢出5、7、6種醛類物質，其中共有的醛類有4種；總醛類物質相對含量分別為0.44%、1.13%和1.06%，占總香氣成分的0.29%、0.42%和0.54%。

苯甲醛是啤酒中含量最高的低揮發性醛類，具有苦杏仁的堅果香氣[37]。Can酒樣的苯甲醛相對含量（0.43%）顯著高于其他酒樣。乙醛是啤酒中含量最高的揮發性醛類，含量過高會賦予酒體濃重的青草味、縮短貨架期[38]。作為啤酒中顯著的香氣成分特征，Ger酒樣的乙醛含量顯著高于其他酒樣，形成顯著的生酒味。

3種酒樣中，Eng酒樣中醛類香氣物質相對含量較低；Can酒樣中醛類香氣物質種類最為豐富，總醛含量最高，保留啤酒的典型性的同時，也造成了酒樣的老化風味；Ger酒樣中醛類香氣物質含量雖相較Can酒樣偏低，但占該酒樣總香氣成分的百分比最高。

2.3.4 酮類物質分析比較

3種啤酒共檢測出仲辛酮等7種酮類，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分別共檢出7、6和6種酮類物質，其中共有的酮類有5種；酮類物質總相對含量分別為0.16%、0.19%和0.36%，占總香氣成分的0.11%、0.07%和0.18%。

3種酒樣中，Eng酒樣的酮類香氣物質種類最為豐富，Ger酒樣中總酮類香氣物質含量最高。雖然丙酮等共有酮類的含量無較大差異；但Ger酒樣中仲辛酮的相對含量最高（0.22%），賦予酒樣濃烈的霉香、酮香，并伴有牛奶、乳酪、蘑菇的氣味，而Can酒樣中未檢出仲辛酮。

2.3.5 酸類物質分析比較

3種啤酒共檢測出辛酸、正癸酸、己酸等9種酸類物質，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分別共檢出7、6和9種酸類物質，其中共有的酸類有5種；酸類物質總相對含量分別為44.41%、83.48%和13.78%，占總香氣成分的29.56%、30.70%、39.99%。

Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中，辛酸的相對含量最高，分別占總酸的72.42%、79.10%和59.18%；癸酸次之，分別占總酸的12.95%、12.59%和29.70%。二者皆是酒體“酸敗味”的代表物質。易形成酒體的腐臭味，導致啤酒的品質下降，其中Can酒樣中辛酸（66.03%）和Ger酒樣中癸酸（23.20%）的相對含量，均顯著高于其他酒樣。同時，具有雄山羊味的己酸在3種酒體中均被檢出，且Can酒樣中的相對含量最高（5.04%），易形成酒體的辛基風味，加劇酒體的酸敗。Can、Ger酒樣的總酸含量趨于Eng酒樣的兩倍，證明釀造過程中原料的不同，會直接造成成品酒中的游離脂肪酸含量的顯著差異。

綜合香氣成分分析結果，苯乙醇（玫瑰香）、異戊醇（甜味）、辛酸乙酯（茴香味）、正己酸乙酯（菠蘿香、曲香）等物質是啤酒酒體香氣的主要成分。與其他酒樣相比，Can酒樣的香味物質種類最多（75種）、相對含量最高（271.82%），香型豐富、香氣濃郁飽滿。雖然酒體醇酯比偏低，但其總醇、總酯的含量較高，酒體香氣復雜、醇厚和諧。進一步證明了加拿大麥芽相較其他麥芽更適合于Lager啤酒釀造。

3 結論

本研究通過對3種不同種類麥芽的浸出物、α-氨基酸態氮、糖化力、庫爾巴哈值等品質指標及所釀啤酒的酒精度、原麥汁濃度、實際濃度、外觀濃度、實際發酵度、外觀發酵度等理化指標檢測，同時采用GC-MS分析比較其酒體風味成分差異。結果表明，相較英國麥芽和德國麥芽，加拿大麥芽的庫爾巴哈值（45%）和浸出率（≥77%）適中、糖化力較高（414 WK）、α-氨基酸態氮偏低（118 mg/L）；同時，其發酵液酒精度較高（2.97%vol）、原麥汁濃度適中（8.63°P）；啤酒濃度較低（實際濃度2.76%、外觀濃度1.17%）、發酵度較高（實際發酵度67.97%、外觀發酵度86.41%）。最終確定加拿大麥芽相較其他麥芽更適于實驗室模擬體系中Lager啤酒的釀造生產。