紅曲霉和乳酸菌發(fā)酵低溫豬肉火腿腸工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

葉 陽(yáng)，曾德玉，劉紅梅，劉自山，王 洋*

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

火腿腸具有適口性好、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者青睞。亞硝酸鹽在高溫肉制品中常用于發(fā)色和防腐，但亞硝酸鹽具有強(qiáng)致癌性[1]。因此，人們?cè)趯ふ襾喯跛岬奶娲镆詼p少亞硝酸的使用量。目前多采用外源添加物[2-4]、發(fā)酵[5-6]的方式部分替代亞硝酸鹽。眾多的研究表明，發(fā)酵可顯著提高肉制品的品質(zhì)，其富含的蛋白質(zhì)、脂肪等經(jīng)過微生物氧化分解成氨基酸和短肽更易被人體吸收[7]，改善了肉制品的品質(zhì)，但其發(fā)酵工藝受原料及輔料、發(fā)酵劑種類[8-9]、發(fā)酵時(shí)間和溫度、添加量[10]等因素的影響較大。郭丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌添加量、發(fā)酵溫度和時(shí)間能顯著提高肉制品亞硝酸鹽清除率和感官品質(zhì)，促進(jìn)氨基酸含量增加[12]。發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶和酸類物質(zhì)，促進(jìn)亞硝酸鹽的降解[13-14]。LIU D C等[15]研究發(fā)現(xiàn)，接種過紅曲霉（Monascus）的0.25%安卡米能代替香腸中75%的亞硝酸鹽發(fā)色。1010CFU/mL乳酸菌發(fā)酵能全部代替香腸中亞硝酸鹽發(fā)色[16]。低溫肉制品集營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味、安全于一體，是肉制品的發(fā)展方向。然而，受生產(chǎn)工藝等因素影響，褪色現(xiàn)象在低溫肉制品中普遍存在，對(duì)亞硝酸鹽的使用量和替代物的選擇提出了更高的要求。袁玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液可代替低溫火腿腸中2/3亞硝酸鈉，且李燚等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉發(fā)酵可促進(jìn)低溫火腿腸發(fā)色，但少有將紅曲霉（Monascus）和乳酸菌（lactic acid bacteria）聯(lián)合發(fā)酵，探究低溫火腿腸的發(fā)酵工藝。本研究以豬肉為原料，利用紅曲米和乳酸菌菌粉為發(fā)酵劑，研制低溫豬肉火腿腸，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并對(duì)低溫豬肉火腿腸品質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為實(shí)現(xiàn)低硝低溫肉制品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉、食鹽、紅曲米、乳酸菌發(fā)酵菌粉（包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌）、孜然、胡椒粉、辣椒面、白砂糖、味精：購(gòu)于沃爾瑪超市；膠原蛋白腸衣（直徑3 cm）：廣州德福隆生物科技有限公司；亞硝酸鹽、復(fù)合磷酸鹽、異抗壞血酸（均為分析純）、淀粉（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250C生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；YX-18HM手提式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BCD-258WDP冷藏冷凍箱：青島海爾股份有限公司；WFJ7200可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：天津市賽得利斯有限公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀：英國(guó)Stable Micro Systems UK公司；UltraScan VIS臺(tái)式色差儀：上海韻鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TK-12型絞肉機(jī)：浙江應(yīng)曉工貿(mào)有限公司；MJ-BL25C4型斬拌機(jī)：廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫豬肉火腿腸制作工藝流程及操作要點(diǎn)

原料整理→分割→絞肉→腌制→斬拌乳化→接種紅曲霉、乳酸菌→灌制→蒸煮→烘烤、冷卻→低溫豬肉火腿腸成品

操作要點(diǎn)：

原料豬肉的挑選：原料選取一定的豬肉肥膘與精肉搭配，肥瘦比為2∶8（g∶g），挑選的肉冷卻至3～5 ℃后再進(jìn)行加工。

絞肉：將原料瘦肉剔除結(jié)締組織以及可見脂肪部分，切成1～2 cm見方的小塊，用絞肉機(jī)將其絞成肉餡待用，控制肉溫10 ℃左右，將肥膘切成1～2 cm見方的小塊。

腌制：在絞碎的瘦肉中加入2.5%食鹽、4 mg/kg亞硝酸鹽、0.03%異抗壞血酸、0.1%孜然、0.1%胡椒粉、0.1%辣椒面、0.1%白砂糖、0.1%味精，攪拌5～10 min混合均勻，排凈肉糜表面氣泡，然后用保鮮膜包好置于4 ℃、相對(duì)濕度85%～90%條件下腌制2 h。

斬拌乳化：斬拌前先用冰水（肉質(zhì)量20%）將斬拌機(jī)降溫至10 ℃左右，然后投放腌制好肉糜斬拌2 min，接著倒入脂肪末，最后加入6%淀粉攪拌均勻，斬拌3.5 min使原料肉與輔料充分結(jié)合，達(dá)到最佳的乳化效果。

紅曲霉溶液制備：以鮮肉糜為基準(zhǔn)，將研磨后的紅曲米粉中加入無(wú)菌水，充分溶解，制成一定濃度的紅曲霉溶液。

乳酸菌菌懸液制備：以鮮肉糜為基準(zhǔn)，在無(wú)菌條件下，在乳酸菌發(fā)酵菌粉中加入一定比例的無(wú)菌水，攪拌均勻，制成一定濃度乳酸菌菌懸液。

接種紅曲霉和乳酸菌：一定量的紅曲霉、乳酸菌均勻加入經(jīng)斬拌乳化后的肉糜中，于相對(duì)濕度92%～96%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下發(fā)酵不同時(shí)間。

灌制及排氣：將接種好的肉餡放入直徑約3 cm的豬腸衣中，并用排氣針在腸衣上扎孔排氣，灌腸時(shí)肉餡的溫度不超過2 ℃。填充時(shí)需小心，盡量減少肉餡中的空氣，松緊適度。

蒸煮：在90 ℃的水浴鍋中加熱腸體，用探針式溫度計(jì)測(cè)定腸心溫度，待蒸煮后腸心溫度達(dá)到70 ℃左右時(shí)停止加熱，撈出冷卻晾干。

烘烤：60 ℃的烘箱中烘烤30 min，使腸體本身呈現(xiàn)具有彈性而腸體表面不會(huì)出現(xiàn)失水塌陷的情況。

冷卻：豬肉腸烘烤后冷卻至室溫，得到低溫豬肉火腿腸成品。

1.3.2 分析檢測(cè)

（1）理化指標(biāo)測(cè)定

全質(zhì)構(gòu)分析（texture profile analysis，TPA）：參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定。色差：參照文獻(xiàn)[20]，每組隨機(jī)選取3只火腿腸，切成薄片，用色差儀測(cè)定各試驗(yàn)組及對(duì)照組的明亮度（L*值）、紅綠色（a*值）、黃藍(lán)色（b*值）及色差值（ΔE），其中ΔE的計(jì)算公式如下：ΔE=

pH值：采用GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》中方法進(jìn)行測(cè)定；亞硝酸鹽：按照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中方法進(jìn)行測(cè)定；氨基酸含量：采用GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中方法進(jìn)行測(cè)定；菌落總數(shù)：GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定》。

（2）低溫豬肉火腿腸感官評(píng)分方法

低溫豬肉火腿腸感官質(zhì)量評(píng)分參照GB 20712—2006《火腿腸》，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。感官評(píng)定由15名專業(yè)人員組成的感官評(píng)定小組參照按照國(guó)標(biāo)GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》對(duì)火腿腸的色澤、組織形態(tài)、風(fēng)味、滋味4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)定，滿分100分。

表1 低溫豬肉火腿腸感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of low-temperature pork ham sausage

續(xù)表

1.3.3 發(fā)酵火腿腸單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取100 g/份豬肉，2.5%食鹽、4 mg/kg亞硝酸鹽、0.03%異抗壞血酸、適量的香辛料和調(diào)味料，紅曲霉添加量分別為（0、1.4%、2.8%、4.2%、5.6%）、乳酸菌添加量分別為（0、3%、4%、5%、6%）、發(fā)酵時(shí)間（38 h、40 h、44 h、48 h、52 h）條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各影響因素對(duì)火腿腸的氨基酸含量、感官評(píng)分、亞硝酸鹽含量、pH、硬度及色差的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選擇紅曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests design

1.3.5 產(chǎn)品保藏試驗(yàn)

以響應(yīng)面優(yōu)化后的配方制成的低溫豬肉火腿腸成品為試驗(yàn)組，僅加入0.03%的亞硝酸鹽制成的低溫豬肉火腿腸為對(duì)照組，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，兩組產(chǎn)品置于37 ℃條件下保藏21 d（相當(dāng)于4 ℃條件下保藏194 d，即6個(gè)月的保質(zhì)期），每7 d測(cè)定兩組樣品的菌落總數(shù)，觀察產(chǎn)品的色澤。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件、Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 紅曲霉添加量對(duì)火腿腸品質(zhì)的影響

由表3可知，隨著紅曲霉添加量在0～5.6%范圍內(nèi)的增加，火腿腸的氨基酸含量顯著增加（P＜0.05），亞硝酸鹽含量、pH和硬度逐漸降低，感官評(píng)分先增加后降低，色差值先降低后增加。可能是因?yàn)榧t曲霉添加量增加，紅曲霉初級(jí)代謝產(chǎn)物蛋白酶增多，這些蛋白酶能將大分子蛋白質(zhì)分解為多肽、氨基酸等，所以氨基酸含量增加[21]。pH值先大幅下降后緩慢下降再趨于穩(wěn)定是因?yàn)榧t曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的堿性蛋白酶平衡了pH的迅速降低[22]，有助于火腿腸品質(zhì)的穩(wěn)定；紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素、乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)，兩者對(duì)亞硝酸鹽起到降解作用[23-24]，因而亞硝酸鹽含量降低。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的代謝酶系，使火腿腸的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生水解，產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì)，酪蛋白原有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，肉糜發(fā)酵體系變得軟柔而均勻的組織結(jié)構(gòu)改善了質(zhì)構(gòu)特性，即破壞了肉中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，引起了硬度的變化[25]，另外紅曲霉具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可有效地抑制肉制品中脂肪和蛋白質(zhì)的氧化腐敗，能在一定程度上改善肉制品的劣變[26]。紅曲霉添加量為4.2%時(shí)，此時(shí)亞硝酸鹽含量為18.5 mg/kg，與空白組相比，亞硝酸鹽減少了8.8 mg/kg，產(chǎn)品色差值（ΔE）最小（11.6），感官評(píng)分最優(yōu)78.2分。因此，最適紅曲霉添加量為4.2%。

表3 紅曲霉添加量對(duì)低溫豬肉火腿腸品質(zhì)的影響Table 3 Effect of Monascus addition on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.1.2 乳酸菌添加量對(duì)火腿腸品質(zhì)的影響

由表4可知，隨著乳酸菌添加量在0～6%范圍內(nèi)的增加，氨基酸含量先增加后穩(wěn)定，色差值先降低后增加，而亞硝酸鹽、pH值顯著降低（P＜0.05），硬度顯著增加，根據(jù)多重比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的乳酸菌添加量的各個(gè)組之間對(duì)于硬度的差異顯著。且在一定范圍內(nèi)增加添加量可以增加產(chǎn)酸，但酸度過低會(huì)掩蓋發(fā)酵火腿腸的固有風(fēng)味，帶來(lái)不良的感官品質(zhì)。硬度隨添加量的增加逐漸增加，與紅曲霉添加量對(duì)火腿腸硬度的影響不同，因?yàn)槿樗峋鷶?shù)增加，發(fā)酵產(chǎn)酸量增加，導(dǎo)致pH的迅速下降，酸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性和凝膠反應(yīng)，從而增加其硬度[27]。乳酸菌添加量為5%時(shí)，亞硝酸鹽含量減少26.1 mg/kg，因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶和酸性物質(zhì)，可降低亞硝酸鹽含量[28]，此時(shí)火腿腸色差值（ΔE）最小（7.5），感官評(píng)分最高78.7分。因此，最適乳酸菌添加量5%。

表4 乳酸菌添加量對(duì)火腿腸品質(zhì)的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria addition on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)火腿腸品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間是評(píng)價(jià)發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。由表5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在38～52 h的延長(zhǎng)，氨基酸含量、硬度和感官評(píng)分先增加后降低，亞硝酸鹽顯著下降（P＜0.05），而pH先緩慢下降后穩(wěn)定。發(fā)酵時(shí)間為38～44 h時(shí)，發(fā)酵肉中的蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)進(jìn)一步降解，表現(xiàn)為氨基酸含量增加，發(fā)酵時(shí)間＞44 h之后，肉中某些氨基酸轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[29-30]，使氨基酸含量降低。由前面研究可知，單一菌種發(fā)酵，乳酸菌添加量為5%時(shí)，火腿腸亞硝酸鹽含量為27.3 mg/kg，紅曲霉添加量為4.2%時(shí)，亞硝酸鹽含量為28.9 mg/kg，4.2%紅曲霉和5%乳酸菌混合發(fā)酵38 h火腿腸亞硝酸鹽含量為13.9 mg/kg，聯(lián)合發(fā)酵比紅曲霉、乳酸菌單菌種發(fā)酵其亞硝酸鹽分別降低了15 mg/kg、13.4 mg/kg，表明紅曲霉和乳酸菌混合發(fā)酵能顯著降低亞硝酸鹽含量，可能是因?yàn)樵谌樗峋罅看嬖诘那闆r下，紅曲霉的生長(zhǎng)會(huì)受到部分抑制[31]，使乳酸菌更好地發(fā)揮作用，同時(shí)紅曲霉發(fā)酵促進(jìn)亞硝酸鹽的降解，從而加快亞硝酸鹽含量的下降。發(fā)酵時(shí)間對(duì)火腿腸的硬度影響顯著，可能是蛋白質(zhì)變性、凝膠反應(yīng)體系和水分的變化，導(dǎo)致硬度增加[27]。發(fā)酵時(shí)間為44 h時(shí)，火腿腸的色差值（ΔE）最小（15.7），感官評(píng)分較高為80分。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為44 h。

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)低溫豬肉火腿腸品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation time on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸模型顯著性分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇紅曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表6，通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

續(xù)表

以感官評(píng)分為響應(yīng)值（Y）建立數(shù)學(xué)模型，得到回歸方程如下：

Y=76.52+2.44A+3.45B+0.062C-4.83AB-2.20AC-1.68BC-3.14A2+1.84B2-3.68C2

表7 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test of regression model coefficient

由表7可知，模型P=0.001 2＜0.05，失擬項(xiàng)P=0.458 9＞0.05，說(shuō)明該模型自變量與因變量之間函數(shù)關(guān)系顯著，幾乎不存在失擬現(xiàn)象。決定系數(shù)R2=0.880 4，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.726 7，說(shuō)明模型擬合度高，用于模擬試驗(yàn)結(jié)果可靠。A、B、AB、A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），BC、B2、C表現(xiàn)為不顯著（P＞0.05），各因素對(duì)感官評(píng)分順序?yàn)槿樗峋砑恿浚炯t曲霉添加量＞發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析及最優(yōu)工藝驗(yàn)證

由圖1可知，乳酸菌添加量一定時(shí)，紅曲霉添加量和發(fā)酵時(shí)間逐漸增加時(shí)，感官評(píng)分呈先升高后降低趨勢(shì)，說(shuō)明交互作用明顯。通過以上模型得到的火腿腸最佳發(fā)酵工藝為紅曲霉添加量3.66%、乳酸菌添加量為5.00%，發(fā)酵43.86 h，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為81.81分。為了便于實(shí)際操作，將上述優(yōu)化的發(fā)酵條件修正為紅曲霉添加量4.0%、乳酸菌添加量為5.0%，發(fā)酵44 h。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到火腿腸的感官評(píng)分實(shí)際值為82.5分，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明最優(yōu)發(fā)酵工藝條件可靠。

由表8可知，37 ℃條件下保藏7 d，試驗(yàn)組與對(duì)照組菌落總數(shù)差別不大；37 ℃條件下保藏14 d、21 d時(shí)，試驗(yàn)組菌落總數(shù)略高于對(duì)照組，但差別不大，說(shuō)明紅曲霉和乳酸菌確實(shí)能夠抑制微生物的生長(zhǎng)，達(dá)到延長(zhǎng)保質(zhì)期的目的。兩組產(chǎn)品21 d后菌落總數(shù)低于國(guó)標(biāo)GB 2726—2016《熟肉制品》中菌落總數(shù)要求（＜20 000 CFU/g），符合衛(wèi)生要求。

試驗(yàn)組與對(duì)照組的感官評(píng)分分別為82.5分、81.9分，實(shí)驗(yàn)組方差分析表明，試驗(yàn)組的紅曲霉和乳酸菌的防腐作用與對(duì)照組亞硝酸鹽的作用基本一致，即3.66%的紅曲霉添加量和5.00%的乳酸菌添加量的聯(lián)合作用能夠代替84.31%的亞硝酸鹽對(duì)火腿腸進(jìn)行防腐保鮮，其火腿腸色澤明亮，呈淺紅色。

圖1 各因素交互作用對(duì)火腿腸感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the sensory score of low-temperature pork ham sausage

表8 低溫豬肉火腿腸菌落總數(shù)在保藏期內(nèi)的變化Table 8 Changes of total bacteria count of low-temperature pork ham sausage in the preservation period

3 結(jié)論

低溫豬肉火腿腸經(jīng)紅曲霉和乳酸菌發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著提高，火腿腸色澤明亮，呈淺紅色。最佳發(fā)酵工藝條件為紅曲霉4.0%、乳酸菌5.0%，發(fā)酵44 h。在此優(yōu)化條件下，腸體呈淺紅色，口感柔和，感官評(píng)分為82.5分，pH值6.24，亞硝酸鹽含量為4.9 mg/kg。保藏試驗(yàn)表明，紅曲霉4.0%和乳酸菌5.0%可以替代84.31%的亞硝酸鹽對(duì)低溫豬肉火腿腸進(jìn)行發(fā)色。