有機氮和酵母細胞壁對赤霞珠高糖原料酒精發酵的影響

許引虎，李 輝*，熊 濤，覃先武，陽慧慈，聶文強，張方方，李志軍

（安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443200）

全球變暖對葡萄的采收和品質都有不同程度的影響，葡萄果實中的總糖增加，與此同時果糖的濃度也在增加[1]。高糖度的發酵條件下，在發酵的初期酵母會受到高糖造成的高滲透壓脅迫，另外在發酵的后期高濃度的酒精會對酵母有強烈的抑制作用[2-4]，尤其乙醇含量的增加對酵母對于果糖的利用的抑制作用要高于葡萄糖[5-6]，因此在發酵后期往往導致發酵不徹底，殘糖過高尤其是果糖，而果糖的甜度是葡萄糖的兩倍對葡萄酒的口感及后期儲存帶來不利影響[7-8]。

酵母在酒精發酵過程中所需要的營養成分以氮源最為重要，葡萄汁中的氮源可分為有機氮和無機氮，有機氮主要包括氨基酸、多肽和蛋白質，無機氮主要是銨態氮和硝態氮，其中酵母能夠直接利用的氮源稱為可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN），包括游離氨基酸（脯氨酸除外）、小分子多肽和銨態氮[9-11]。酵母可以直接吸收氨基酸用于蛋白質合成，不需要通過自身代謝合成所需要的氨基酸[12]，氨基酸的添加可以增強合成葡萄糖轉運蛋白的能力，代謝糖的能力更強。研究表明添加可同化氮刺激酵母對果糖的利用要高于對葡萄糖的利用。因此對于高糖度的葡萄原料在酒精發酵過程中通過合理補充氮源可以預防發酵不徹底[13]，避免果糖殘留過多。酵母細胞壁又叫酵母皮（yeast hull），占細胞干質量的10%～25%，酵母細胞壁的網狀結構有助于吸附酵母在發酵過程中產生的中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸和癸酸）、農藥殘留、赭曲霉素A等有害物質[14-15]。另外酵母細胞壁中富含甾醇和不飽和脂肪酸等生長因子，這些生長因子有助于保持膜的流動性，維持細胞膜的生物活性，增強細胞對乙醇的耐受性[16]。氧氣的存在是酵母合成麥角甾醇和不飽和脂肪酸所必須的，在酒精發酵的無氧條件下，酵母可以吸收發酵液中的不飽和脂肪酸和甾醇并結合到細胞膜中。此外酵母細胞壁在加入葡萄醪/葡萄汁后部分不溶的成分懸浮在發酵液中可以作為二氧化碳的成核中心，降低二氧化碳的溶解度，減輕二氧化碳對酵母的毒害[17]。

在寧夏和新疆葡萄產區經常會遇到葡萄原料糖度過高發酵緩慢甚至停滯的問題，為了提高葡萄酒酵母在高糖度條件下的發酵性能使酒精發酵更為徹底，本研究在高糖度條件下通過在發酵過程中添加酵母源有機營養和酵母細胞壁進行實驗，對比了單一有機氮源和酵母細胞壁在不同添加時期的效果的差異，以及有機氮源與酵母細胞壁配合添加與單一添加的差異，以期為高糖度葡萄原料的酒精發酵提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄汁（寧夏紅寺堡產區赤霞珠葡萄，總糖286.2 g/L，調整后總酸8.8 g/L，發酵液濁度332 NTU）：寧夏長城天賦酒莊。

葡萄酒活性干酵母CEC01、酵母源有機氮源FN502、酵母細胞壁CW101：安琪酵母股份有限公司。

L-酒石酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、果糖（均為分析純）：美國Sigma公司；無水乙醇（色譜純），硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-系列生化培養箱：上海一恒科技有限公司；BSA2202S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LKTC-B1-T恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠；PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；ZORBAX碳水化合物分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、HP1100高效液相色譜儀（具有示差折光檢測器和自動進樣器）：美國安捷倫公司；SHZ曲型循環水真空泉：鄭州長城科工貿有限公司；KQ100DB型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒精發酵

選擇晚采收的赤霞珠葡萄作為發酵原料，為減小葡萄原料不均勻帶來的誤差，本實驗采用未澄清的葡萄汁進行發酵實驗。取260 mL發酵原料置于500 mL三角瓶中，然后接種酵母，酵母接種量250 mg/L，放入恒溫培養箱中發酵，溫度設為25 ℃。每隔24 h在同一時間點測定一次發酵處理樣的質量，通過前后的質量差代表CO2的生成量，并根據每天的CO2生成量繪制發酵曲線。根據CO2的生成量確定營養的添加時間，首先根據每個三角瓶中發酵液的體積及發酵液的糖濃度估算出總的CO2的生成量（約為41 g），然后根據CO2的生成量分別在發酵的初始階段、發酵的1/6、1/3、1/2、2/3（對應的CO2的生成量分別為0、6.8 g、13.7 g、20.5 g、27.3 g）添加酵母源有機氮FN502或者酵母細胞壁CW101，添加量為200 mg/L，分別用FN0、FN1、FN2、FN3、FN4和CW0、CW1、CW2、CW3、CW4表示。另外設置了4種有機氮FN502和酵母細胞壁CW101的組合添加方案：（1）在發酵進行1/3時同時添加FN502和CW101（各添加200 mg/L）；（2）在發酵進行1/6時添加FN502，在發酵進行1/2時添加CW101（各添加200 mg/L）；（3）在發酵進行1/3時添加FN502，發酵進行2/3時添加CW101（各添加200 mg/L）；（4）在發酵進行1/2時同時添加FN502和CW101（各添加200 mg/L），分別用FC1、FC2、FC3、FC4表示。當24 h間隔CO2的生成量＜1.0 g時，可以判定酒精發酵基本結束。每個處理樣設置2個重復。

1.3.2 酒樣常規理化指標測定

酒精參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》[18]測定。

1.3.3 葡萄糖、果糖、總殘糖含量的測定

發酵樣品的處理：將發酵樣品在取樣容器中混勻，取混勻后的適量樣品4 000 r/min離心10 min，精密稱取一定質量離心后的上清液至容量瓶中，用純水定容并稀釋合適的倍數，使其濃度在曲線范圍內，將稀釋后溶液經0.45 μm濾膜過濾后上機測試。

色譜條件：用0.005 mol/L H2SO4溶液作為流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫65 ℃，平衡流動相待儀器基線走平穩后進樣，進樣量為20 μL。

通過液相檢測出葡萄糖和果糖的含量，總殘糖=葡萄糖+果糖。

1.3.4 數據分析

運用SPSS 22.0軟件在0.05水平下進行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，采用Origin Pro 9.0進行數據統計和繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵曲線

圖1 不同發酵時期添加有機氮FN502的發酵曲線Fig.1 Fermentation curve of adding organic nitrogen FN502 in different fermentation periods

由圖1可知，與對照（未添加FN502或CW101）相比，當有機氮FN502和酵母同時加入葡萄汁后，在最開始并沒有明顯的提高酒精發酵的速度，而在酒精發酵進行1/6時添加有機氮FN502明顯提高了酒精發酵速度，在酒精發酵后期二者的發酵速度基本一致；在酒精發酵進行1/3時添加有機氮FN502，酒精發酵速度得到迅速提升；在發酵進行1/2時添加有機氮FN502，對酒精發酵速度的提升較為緩慢；而在酒精發酵進行2/3時添加有機氮FN502，則對酒精發酵的速度沒有明顯的影響，葡萄酒酵母在指數生長期之后由于代謝所產生的酒精及中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸和癸酸）的抑制作用使酵母的細胞膜流動性變差，同時細胞膜上的轉運蛋白活性降低[19]，導致對營養物質的吸收能力下降[20]，因此需要在酵母活性生長過程中提供給細胞營養及生存因子，在酒精發酵的中后期一旦生長停止，即使補充營養和生存因子也不能達到理想的效果[21]。

發酵結束時，在酒精發酵進行1/3時添加有機氮FN502的處理組最終產生的CO2總質量顯著高于對照和其他處理組（P＜0.05），在酵母接種時同時添加有機氮FN502和在酒精發酵進行1/6及1/2時添加有機氮FN502，三種處理之間最終產生的CO2總質量沒有明顯差異（P＞0.05），但均顯著高于對照和在酒精發酵進行2/3時添加有機氮FN502的處理組（P＜0.05）。而在酒精發酵進行2/3時添加有機氮FN502則與對照沒有明顯差異（P＞0.05）。說明在發酵進行1/3時添加有機氮FN502效果最好，此時正值酵母生長的對數期，酵母生長繁殖活躍，酵母吸收營養的能力更強，同時也需要更多的營養來促進細胞合成，在酒精發酵的中后期對酒精的耐受性和代謝糖的能力也相對更強。

圖2 不同發酵時期添加酵母細胞壁CW101的發酵曲線Fig.2 Fermentation curve of adding yeast cell wall CW101 in different fermentation periods

由圖2可知，與對照相比，在酒精發酵的不同時期添加酵母細胞壁CW101對整個酒精發酵速度沒有顯著的影響，尤其酵母細胞壁CW101在酵母接種后立即添加，在發酵的起始階段還會對發酵速度產生一定的抑制作用，但在發酵3 d后發酵速度開始逐漸超過對照。在酒精發酵結束后，不同時期添加酵母細胞壁CW101的處理組最終產生的CO2總質量與對照相比沒有明顯差異（P＞0.05）。對于過度澄清的葡萄汁，其中懸浮的顆粒同時被去除，濁度降低的同時，顆粒表面吸附的營養和生存因子也會被除去，因此會更容易出現發酵緩慢甚至發酵停滯，而酵母細胞壁的添加可以增加葡萄汁的濁度，NICOLINI G等[22]研究認為葡萄汁的濁度在100 NTU上下是能夠保持果香又能夠防止發酵停滯的最佳折中濁度。另外酵母細胞壁含有豐富的甾醇和不飽和脂肪酸等生存因子，酵母在生長繁殖過程中可以吸收這些生存因子以提高對酒精的耐受性，促進糖的消耗，另外酵母細胞壁可以作為CO2的成核中心，細小的CO2聚集在細胞壁周圍形成更大的氣泡析出，從而降低CO2的溶解度，減輕CO2對酵母細胞的毒害。

圖3 不同發酵時期組合添加有機氮FN502和酵母細胞壁CW101的發酵曲線Fig.3 Fermentation curve of adding organic nitrogen FN502 and yeast cell wall CW101 in different fermentation periods

由圖3可知，與對照相比，處理組FC-1可以明顯的快速提高酒精發酵速度（P＜0.05）；處理組FC-3與FC-1的作用效果相近，二者沒有明顯的差異（P＞0.05）。與對照相比，處理組FC-2對酵母的酒精發酵速度沒有明顯的提升（P＞0.05），而處理組FC-4與對照相比雖然對酒精發酵速度有明顯的提升（P＜0.05），但是與FC-2相比差異不明顯（P＞0.05）。在發酵結束后，FC-1和FC-3最終產生的CO2總質量沒有顯著差異（P＞0.05），二者均顯著的高于對照和FC-2和FC-4（P＜0.05）；FC-4顯著高于對照（P＜0.05），但與FC-2相比差異不顯著（P＞0.05）；FC-2與對照相比沒有顯著的差異（P＞0.05）。以上結果說明FC-1和FC-3處理組對酵母酒精發酵的促進作用最好。

2.2 發酵結束后酒精度與乙酸結果分析

由表1可知，單獨添加有機氮FN502時，在酒精發酵進行1/3時添加有機氮FN502，酵母最終的發酵酒精度最高，最高為16.6%vol；單獨添加酵母細胞壁CW101時，處理組CW-3的最終酒精度最高，為16.4%vol；當有機氮FN502和酵母細胞壁CW101組合使用時，FC-1和FC-3的最終酒精度最高，均為16.9%vol，均顯著的高于對照和其他添加方式（P＜0.05）。與對照相比，酵母有機氮FN502和酵母細胞壁CW101的添加均顯著降低了乙酸的產生（P＜0.05），其中有機氮FN502在酒精發酵進行2/3之前效果最好，酵母細胞壁CW101在酒精發酵進行1/2時效果最好。

表1 酒樣酒精度和乙酸含量檢測結果Table 1 Detection results of alcohol content and acetic acid contents of wine samples

2.3 發酵結束后葡萄糖和果糖結果分析

圖4 不同酒樣酒精發酵結束后葡萄糖、果糖含量和果糖/葡萄糖對比Fig.4 Comparison of glucose,fructose contents and fructose/glucose in different wine samples after alcoholic fermentation

由圖4可知，有機氮FN502單獨添加時，在酒精發酵進行1/3時添加有機氮FN502，最終總殘糖最低，總殘糖為3.60 g/L；與對照相比，在酒精發酵的不同時期添加有機氮FN502均降低了最終的總殘糖；最終殘糖以果糖為主，果糖的含量大概是葡萄糖含量的4～24倍。酵母對于葡萄糖和果糖的代謝存在明顯的差異，雖然果糖與葡萄糖同時使用，但葡萄糖首先從發酵液中耗盡，這導致發酵過程中消耗的葡萄糖和果糖數量之間的差異[23-24]。FN-0、FN-1、FN-2和FN-3的果糖/葡萄糖的比值均比對照小4～5倍左右，由此可見有機氮FN502的添加促進了果糖的消耗，這與左松等[25]的研究結果一致，而由于果糖和葡萄糖共用一套膜運輸和酶催化體系，所以就導致葡萄糖的利用相對下降，因此FN-0、FN-1、FN-2和FN-3處理組發酵結束后葡萄糖的含量反而均高于對照。而在酒精發酵進行2/3時添加有機氮FN502對果糖消耗的促進作用則相對其他4種處理更小。酵母細胞壁CW101單獨添加時，5種添加方式對酵母果糖消耗的促進作用均高于對照，但不如有機氮FN502。CW-1、CW-2和CW-3處理組對酵母對果糖消耗的促進作用較小，而又限制了葡萄糖的消耗，所以最終總殘糖相對于CW-0和CW-4要高。有機氮FN502和酵母細胞壁CW101組合添加時，FC-1和FC-3處理組對果糖消耗的促進作用最好，最終總殘糖也最低，總殘糖分別為1.50 g/L和1.58 g/L。

綜合對比有機氮FN502和酵母細胞壁CW101組合添加時FC-1和FC-3對于酵母對果糖的消耗促進作用最好，總殘糖也最低。與對照相比，酵母源有機營養和酵母細胞壁的添加均降低了最終的總殘糖。

3 結論

通過酵母源有機營養和酵母細胞壁的添加，可以提高葡萄酒酵母在高糖度葡萄原料條件下的發酵速度和最終發酵酒度，降低乙酸的產量和最終總殘糖含量。酵母源有機氮FN502單獨添加時，在不同的添加時期對葡萄酒酵母的酒精發酵影響存在差異，其中在酒精發酵進行1/3時添加對葡萄酒酵母的發酵速度促進作用最強，并能促進葡萄酒酵母對果糖的消耗，總殘糖也最低。酵母細胞壁CW101單獨添加時，在不同添加時期對葡萄酒酵母的發酵速度均沒有明顯的促進作用，與對照相比，在酒精發酵進行2/3之前添加均能降低殘總糖，但作用效果不如有機氮FN502。在酒精發酵進行1/3時同時添加有機氮FN502和酵母細胞壁CW101（各200 mg/L），或在酒精發酵進行1/3時添加有機氮FN502（200 mg/L），進行2/3時添加酵母細胞壁CW101（200 mg/L），對葡萄酒酵母的酒精發酵速度及果糖消耗促進作用均高于對照及二者分別單獨使用，最終酒精度均為16.9%vol，總殘糖分別為1.50 g/L和1.58 g/L。有機氮FN502和酵母細胞壁CW101的添加均可顯著（P＜0.05）降低乙酸的產量。