預處理對六種黃酒釀造原料釀造特性的研究

李素萍，馬艷莉 *，丁玉峰，席曉麗，羅建成，于海彥，李 杰

（1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2.南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，河南 南陽 473004）

中國黃酒一般酒精含量為14%～20%（V/V），屬于低度發酵型飲料酒[1-2]。中國黃酒是以谷物、水等為原料，經浸米、蒸煮、拌曲糖化發酵、壓榨過濾、勾兌而成的釀制酒[3]。浙江紹興黃酒的釀制中，米被比喻為“酒之肉”，可見米對黃酒釀造的重要性[4]。南方釀制黃酒所用的大米主要有糯米、粳米和秈米等[5]。北方黃酒的原料主要是黍米、小米和玉米等。紅谷是北方小米的一種，產自南陽盆地，外殼為紅色，別稱紅小米，紅酒谷。由于富含蛋白質與其他功能性成分，紅谷被應用于黃酒釀造。河南黃酒企業也更鐘情于用紅谷釀造黃酒，南陽黃酒年總產量占河南省黃酒產量的80%以上，這也促進了釀酒原料紅谷產業的發展[6]。

浸米與蒸飯是黃酒傳統釀造中重要的預處理工序，大米、小麥等原料中的淀粉受熱吸水糊化后，淀粉因晶體結構被破壞而α化，這樣既有利于淀粉酶和糖化酶作用，又可對原料進行殺菌[7]。原料浸泡后主要成分部分分解，米漿水（浸米水）酸度增加，結果含有高濃度的乳酸（6～15 g/L）[8]。均勻的水分分布和擴散將使蒸煮后的原料具有良好的質構特性，從而提升釀酒過程中微生物的物質利用率[9-10]。風味是由味道和香氣組成的，后者是由煮熟米飯中揮發性化合物與嗅覺受體相互作用所賦予的，預浸泡處理會對米飯的風味產生較大影響[10]。近年來關于原料預處理的報道主要集中在與南方稻米相關的浸泡和蒸煮條件，或水稻品種淀粉特性的差異等方面。LI S等[9]研究了超聲波處理對大米水化和理化性質的影響，發現經超聲波處理的大米具有更短的浸泡和蒸煮時間。TOWATA S等[11]利用同步輻射的x光散射研究了6個水稻品種淀粉的晶體結構，發現浸泡后淀粉薄片結構得以保持，蒸煮后晶體被破壞。張波等[12]從黃酒自然浸米漿水中篩選出1株乳酸菌應用于生物酸化浸米，浸米時間縮短2 d，黃酒酒精度有所提高。毛青鐘等[13]研究了不同品種稻米的浸米特性，發現在同樣條件下浸漬，其米漿水中總酸和微生物是不同的。黃酒生產中，一般采用40%米漿水替代部分投料用水，浸泡過程產生的有機酸和乳桿菌素隨漿水加入以及米飯帶入，可抑制醋酸菌等有害細菌的繁殖生長，確保發酵正常和順利完成[14]。

目前對中國已經產業成熟化的黃酒釀造谷物的預處理過程的系統研究較少。本試驗選取了六種釀酒谷物（紅谷、張雜谷、圓糯米、黍米、金米、粳大米）（紅谷、張雜谷、黍米和金米為北方黃酒工業常用原料；圓糯米和粳大米為南方黃酒工業常用原料），通過原料預處理（浸泡和蒸飯）實驗，對不同谷物的浸米特性及蒸米的風味特性進行分析，探究不同黃酒釀造原料的品種差異性，對黃酒原料的特性分析有助于挖掘食品和酒類發酵的特色優勢品種，為中國黃酒釀造產業的發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅谷：河南南陽當地超市；張雜谷：張家口巡天食品有限公司；圓糯米：食名軒特產店；黍米：鄉農家土特產店；金米：河北保定當地超市；粳大米：保定市萬糧稻谷加工有限公司。

3-辛醇（內標）（純度≥98%）：美國Sigma-Aldrich試劑公司；乙腈、甲醇（色譜級）：上海阿拉丁生化科技有限公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品（純度均＞97%）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸鋅、鹽酸、磺基水楊酸、硫酸鐵（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CP214電子分析天平：奧斯豪儀器（上海）有限公司；5424R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；QL-861渦旋機：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃取纖維頭：美國Supelco公司；LD-CL2010A電磁爐：泉州雅物貿易有限公司；DZKW-C型電熱恒溫水浴鍋：北京光明醫療儀器廠；Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、7890B-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀：美國安捷倫科技公司；TMSPRO食品物性分析儀：美國FTC公司；CR-400色差計：日本柯尼卡美能達公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 浸泡和蒸煮

用25～30 ℃的溫水清洗谷物至洗米水上方無漂浮物。按紹興釀造方法，25 ℃浸米4 d左右，米∶水=1∶2（g∶mL）。浸米要求：米漿水總酸（以乳酸計）＞0.5 g/100 mL；米漿水呈稠狀，水面出現白色薄膜[13]，米粒手捻易碎。用四層無菌紗布瀝干米漿水，使用可調功率電磁爐進行蒸飯，米飯厚度保持在6～7 cm左右；設置功率2 000 W，常壓蒸煮25～35 min。蒸米要求：米飯熟而不糊，外硬內軟，內無生心。將用于取樣的米飯轉移到玻璃燒杯中，待其冷卻至室溫后備用。

1.3.2 分析檢測

（1）顏色特性分析

浸泡后的不同原料的色澤測定：在日光燈下采用Hunter表色系統測定L*值（明度，反映色澤的明亮度），a*值（正數代表紅色，負數代表綠色），b*值（正數代表黃色，負數代表藍色），重復3次。

（2）質構特性分析

浸泡后的不同原料的質構（硬度、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性）測定參照尹爽等[15]的方法。參數設置：型號P/36的圓柱形不銹鋼擠壓探頭，感應力量程為900 N，提升到樣品表面高度為20 mm，形變量為70%，測試前速度為0.5 mm/s，測試速度為0.5 mm/s，測試后速度為1.0 mm/s，觸發力1 N，重復6次，每次測試20顆完整米粒。

（3）米漿水中有機酸和氨基酸分析

有機酸含量分析采用HPLC法。前處理方法[16]：取5 mL米漿水樣品于100 mL容量瓶中，分別加入10.6%的亞鐵氰化鉀2 mL和30%的硫酸鋅2 mL，混合搖勻后用超純水定容，靜置沉淀30 min。然后在4 ℃、4 000 r/min離心5 min。離心后的上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后經Sep-PakC18固相小柱注入液相棕色小瓶進行HPLC有機酸分析。HPLC條件為：Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L NaH2PO4，pH 2.1，流速：0.9 mL/min，進樣量：10 μL，柱溫：30 ℃，檢測波長：210 nm。

氨基酸測定用全自動氨基酸分析儀。所有的分析都進行了3次平行實驗。

（4）蒸飯揮發性風味分析

采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術提取香氣成分[3]。取5 g米飯于20 mL玻璃頂空進樣瓶中，添加內標物300 mg/kg 3-辛醇15 μL，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空三相微萃取纖維頭插入瓶中頂空部分，并保持離樣品表面1.5 cm，于50 ℃恒溫水浴鍋中固相微萃取吸附40 min，然后插入GC進樣口250 ℃解吸7 min，以待進行GC-MS香氣成分分析，每個樣品測定3次。

氣相色譜和質譜的條件參照LIANG J J等[17]的方法，并加以修改。氣相色譜條件：HP-Innowax 毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He）（純度99.999%），流速為1 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為240 ℃。升溫程序：起始溫度設置為40 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min的速度升溫到240 ℃，最后以20 ℃/min的速度升溫到250 ℃，保持8 min。質譜條件：選用電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度為240 ℃，電子能量為70 eV。通過監測40～350 amu范圍內的總離子電流記錄色譜圖。揮發性化合物通過使用（美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數據庫并與純標準品的質譜和保留時間進行比較來鑒定化合物（取匹配度70%以上），采用內標法進行半定量計算。

1.3.3 數據處理

使用Origin Pro 8.6進行繪圖。數據統計分析使用SPSS 25.0分析，組間差異采用單因素方差分析和Duncun多重比較法檢驗。

2 結果與分析

2.1 浸泡過程中不同釀造原料的顏色變化

不同浸泡時間（0、1 d、2 d、3 d、4 d）對不同米粒顏色參數L*值、a*值、b*值的影響結果見表1。由表1可知，對于未浸泡（0 d）的原料，紅谷的a*值最高，圓糯米和粳大米品種a*值較低。此外，糯米的L*值明顯高于紅谷和粳大米，張雜谷和金米的b*值較高。結果表明，紅谷品種顏色較深，呈紅褐色，糯米顏色最淺，呈亮白色，粳大米呈暗白色。同時，張雜谷呈現出的黃色色度值顯著高于金米和黍米（P＜0.05）。

表1 六種釀造原料浸泡過程中的顏色變化Table 1 Color change of six kinds of brewing materials during soaking process

由表1亦可知，浸泡谷物與干谷物（浸泡0 d）的L*值和b*值存在顯著差異（P＜0.05）。浸泡后紅谷、圓糯米和黍米的籽粒亮度（L*值）減少，而張雜谷、金米和粳大米的籽粒亮度（L*值）增加，而紅度（a*值）隨著浸泡時間的增加而先劇烈下降（0～2 d）后保持恒定（3～4 d）。浸泡4 d后的原料米的a*值和b*值低于未浸泡米，反映出常溫浸米后紅色和黃色減少。浸米后紅谷、糯米、黍米品種的L*值下降，表明常溫水處理后谷物變暗，植物色素消溶于水中。浸泡實驗的顏色變化結果表明，某些化合物在浸泡過程中會從內層遷移到表面，而另一些化合物，特別是麩皮化合物則向胚乳擴散。米粒的亮度增加可以通過麩皮化合物向胚乳的擴散（向內擴散）和水稻化合物（脂質）從稻米內層向表面的遷移（向外遷移）來解釋[18]。總的來說，相較于其他谷物，紅谷中的紅色素隨著浸米時間的延長略微減少，但一直顯著高于其他谷物（P＜0.05）。作為有色谷物，紅谷外殼為紅色，其含有的天然紅色素可在后期釀造中增加酒體的顏色，使之呈現琥珀色的光感，從而吸引更多消費者。

2.2 浸泡過程中不同釀造原料的質構變化

黃酒是由浸泡過的不同谷物原料制成的，釀造米的質構特性與蒸煮品質密切相關。質構特性的差異也意味著原料的組成成分以及結構的差異[19]，這些將會影響谷物的后續發酵品質以及在市場上的流通度。浸泡0～4 d不同谷物的硬度、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性變化情況分別見表2～表6。

表2 六種釀造原料浸泡過程中的硬度變化Table 2 Hardness change of six kinds of brewing materials during soaking process

表3 六種釀造原料浸泡過程中的內聚性變化Table 3 Cohesiveness change of six brewing materials during soaking process

表4 六種釀造原料浸泡過程中的彈性變化Table 4 Springiness change of six brewing materials during soaking process

表5 六種釀造原料浸泡過程中的膠黏性變化Table 5 Adhesiveness change of six brewing materials during soaking process

表6 六種釀造原料浸泡過程中的咀嚼性變化Table 6 Chewiness change of six brewing materials during soaking process

由表2可知，浸泡時間的變化對原料的硬度有很大的影響。硬度是材料對變形和斷裂的抗力。隨著浸泡時間的延長，硬度值呈先降低（0～2 d）后增加（3 d）再降低（4 d）的趨勢，其中紅谷的硬度從178.5 N降低至48.2 N。相較于其他原料，圓糯米的下降幅度最大，為89.45%，其次是紅谷，為73.00%，隨后是粳大米和張雜谷。可以觀察到，在浸米第2天，紅谷、金米和粳大米的硬度在統計學上顯著降低（P＜0.05）。這表明浸泡過程中植物組織和細胞膨脹，主要成分部分分解，使谷物的柔軟度增強。不同谷物的內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性參數都呈現與硬度相似的變化曲線。內聚性與樣品分子內部的蛋白質結構或交聯有關[20]。由表3可知，浸泡4 d后紅谷的內聚性與其他谷物存在顯著差異（P＜0.05），這可能與谷物樣品間的差異有關。彈性和膠黏性是谷物質構品質中的重要指標，對應參數值越小，表明其質地越松散。由表4和表5可知，隨著浸泡時間的增加，粳大米的彈性和膠黏性一直處于較高水平（0.48 mm和16.0 N），紅谷在浸米結束后的彈性為0.19 mm，其低于黍米、金米和粳大米品種。圓糯米的膠黏性在浸泡4 d后最低，為1.7 N，其次為紅谷和張雜谷。這表明浸泡處理能加速谷物的內部吸水膨脹，中心結構疏松化，有利于隨后釀造中微生物與酶的作用[21]。咀嚼性是米飯質構品質中的重要指標，與米飯的彈性成正相關。由表6可知，浸米后圓糯米的咀嚼性最高，相反粳大米最低。浸泡過程中紅谷與張雜谷、黍米和金米的彈性、膠黏性和咀嚼性無明顯差異（P＞0.05），與圓糯米和粳大米有顯著差異（P＜0.05），表明小米類和稻米類釀造米存在明顯的品種差異，可能與其內部結構、化學性質有關。一般來說，硬度較高的谷物品種往往具有較高的彈性、膠黏性和咀嚼性。

2.3 不同釀造原料浸泡水中游離氨基酸和有機酸含量的分析

在黃酒生產過程中，米漿水是浸米工序中的副產物。浸米過程中，米漿水中含有大量微生物，同時產生豐富的自溶產物（氨基酸、糖類、維生素和葉酸），隨配料加入及通過蒸米飯帶入發酵醪中，為有益優勢菌群的快速生長提供營養，保證發酵順利完成[13]。對糯米漿水中的微生物進行觀察、檢測發現，漿水中的有機酸（大多為乳酸）主要來源于乳酸桿菌（Lactobacillus）發酵[14]。漿水中的乳酸桿菌的種類和比例，決定著發酵醪液中的乳酸桿菌的種類和比例。另外，米漿水可為黃酒發酵醪提供了豐富的風味前體成分，如氨基酸、乳酸、乙酸、酯類等物質，又經發酵、后熟等過程，促成了黃酒的風味豐富性與復雜性[10，14]。不同品種的米由于產地或化學性質不同，在同樣條件下浸漬，浸米特性也是不同的。因此，研究不同谷物米漿水中的氨基酸和有機酸差異是十分必要的。

浸米結束時，黃酒釀造的六種谷物米漿水中的氨基酸含量和有機酸含量見圖1。由圖1A可知，六種谷物米漿水中共有14種氨基酸，其中谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸占氨基酸總量的70%以上，而粳大米浸泡水中這四種氨基酸的總量高達84.51%。紅谷米漿水的總氨基酸含量最高（976.49 mg/L），其氨基酸含量與其他五種米漿水差異顯著（P＜0.05），約為其他五種原料的米漿水中氨基酸含量1倍左右，其次是黍米、張雜谷、圓糯米、金米和粳大米。這可能是因為在浸泡過程中，微生物特別是乳酸桿菌在米漿水中快速繁殖，具有較強的酸性內肽酶與氨肽酶活力，可分解谷物蛋白質和多肽產生氨基酸[3]。這些酶隨原料進入發酵醪，促進乳酸菌代謝產生大量氨基酸。紅谷中的蛋白質含量高于其他五種谷物原料，導致不同米漿水間的氨基酸差異。

圖1 六種釀造原料浸泡水中氨基酸（A）和有機酸（B）的含量Fig.1 Contents of amino acids (A) and organic acids (B) in soaking water of six brewing materials

有機酸是米漿水中酸度的主要存在形式，與乳酸菌的數量直接相關[21]。由圖1B可知，不同釀造谷物浸泡水中的總有機酸含量顯著不同（P＜0.05）。黍米的總有機酸含量最高（16.62 g/L），其次是張雜谷、粳大米和紅谷，而金米的有機酸含量最低，僅為7.59 g/L。六種米漿水中的主要有機酸是乳酸，其次是乙酸。紅谷中的乙酸、酒石酸和檸檬酸含量高于其他五種谷物浸泡水中的乙酸、酒石酸和檸檬酸含量。這可能與浸泡過程中紅谷米漿水中多糖的分解和氨基酸含量的增加有關，提供微生物生長所需營養，相對應地，乳酸菌代謝得到的有機酸增多[3]。然而，過量的酸會抑制微生物的生長，從而影響產酸率。因此，黃酒生產上要控制好浸米的時間和溫度。米漿水的質量是決定發酵能否順利完成的一個關鍵因素[14]。

紅谷米漿水中的氨基酸含量最高，但有機酸含量相對較低，這也可能與紅谷浸泡期間營養成分損失量小而較少被微生物利用有關。紅谷淀粉分子由于高度支化的樹枝狀結構，在浸米過程中更易吸水溶脹，有利于蒸煮和酸化，使黃酒在發酵初期達到一定的酸度。這種酸性可調節發酵醪液的pH，創造適合酵母菌生長的酸性環境，產生各種風味化合物[10，22]。紅谷比其他谷物具有更高的蛋白質和脂肪含量，作為霉菌和酵母發酵的豐富碳、氮和微量元素來源，對發酵過程中氨基酸與有機酸的積累有很重要的作用。

2.4 蒸煮對不同釀造原料揮發性風味的影響

為探究浸米工藝對蒸煮米飯揮發性風味物質的影響，相同條件下測定6種浸米4 d后的蒸煮米飯的揮發性風味成分，結果見圖2。

圖2 六種釀造原料蒸飯中揮發性風味物質的種類（A）和含量（B）Fig.2 Types (A) and contents (B) of volatile flavor substances in steamed cereal of six brewing raw materials

由圖2A可知，米飯揮發性化合物主要是烴、醛、酮、酸、酯、醇以及雜環化合物等，紅谷、張雜谷、糯米、黍米、金米和粳大米蒸煮米飯中分別共檢測出48種、55種、54種、54種、50種、69種風味物質，六種樣品共檢測出了165種揮發性成分，其中醇類14種，酯類35種，酸類11種，酚類8種，酮類16種，醛類6種。由圖2B可知，醇類、酯類、酸類、酚類、酮類、醛類等6類風味物質分別占各自樣品中總揮發性成分的88.85%、93.52%、87.65%、93.79%、94.82%和91.94%。浸米4 d后張雜谷的米飯揮發性成分含量最高，為222.35μg/100 g，其次是黍米、粳大米和金米，紅谷和糯米的含量最低，分別為143.04 μg/100 g和80.55 μg/100 g。

烴類物質中雖然烷烴占多數，但是烷烴的閾值較高，賦予米飯的香氣較少[23]；相反，醛類、酮類、酸類、醇類等非烴類化合物成為米飯香氣的主要來源[24]。康東方等[25]認為醇類為米飯貢獻甜味和花香，酯類貢獻水果香味，酮類貢獻甜味和輕微的酸味。六種大米蒸飯的揮發性化合物組成顯著不同（P＜0.05）。醇類和酮類化合物含量最高，主要化合物是5-乙基-3-甲基庚-1-烯-4-醇、3-辛酮和L-薄荷酮，而粳大米中L-薄荷酮含量（1.50 μg/100 g）顯著高于其他谷物（P＜0.05）。對于酯類物質，粳大米蒸飯香氣含量較高，紅谷蒸飯香氣含量較低。但紅谷中的吲哚乙酸酯、異戊酸異戊酯和草酸丁環己基甲酯含量高于其他釀酒原料。油卉丹[4]研究發現，浸米工藝能增加米飯中的的非烴類揮發性化合物，如酸類化合物。這是因為浸米過程中乳酸桿菌等微生物的生長繁殖，米粒進行了部分發酵，導致酸類物質積累。酸類化合物主要是丁酸，在紅谷蒸飯中高達10.82 μg/100 g。米飯中對愈創木酚、苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙基苯酚這四種物質的含量相對較高，為紅谷＞張雜谷＞粳大米＞圓糯米＞黍米＞金米，且紅谷中的愈創木酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚含量與其他種類谷物具有顯著差異（P＜0.05）。雜環類和其他化合物含量較少，主要是萘、9-甲基吖啶、2-巰基-4-苯基噻唑和4-乙酰氧基吲哚，粳大米和糯米飯中的四種物質總量高于其他5種谷物。二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃、2-乙酰基噻唑、7H-二苯并（a，g）咔唑和1-氨基蒽是紅谷特有的香氣成分，對米飯的風味有重要影響。釀酒原料品種不同，風味成分有較大差別[24]。蒸飯風味物質的差異可能導致黃酒品質的不同。蒸飯作為黃酒發酵的主體材料，醇、酮、酸類等香氣物質對原料具有貢獻香氣的意義，這些物質可能在原料的黃酒發酵中起著獨特的作用，一部分在釀造過程中轉化成其他產物，一部分參與構成成品酒的風味質量，能給黃酒帶來協調細膩的愉快香氣[1]。

3 結論

本研究通過六種谷物的原料預處理實驗，明確了不同釀酒原料的差異以及紅谷的原料特色。結果表明，浸泡過程中六種谷物的顏色和質構指標變化趨勢大體相似。浸泡4 d后，六種原料的紅度和黃度都有不同程度的降低，粳大米的硬度、彈性和膠黏性浸泡期間顯著高于其他原料（P＜0.05），而紅谷的硬度和彈性相對較低，結構更加疏松。浸泡結束時不同原料浸泡水中的氨基酸和有機酸含量存在顯著差異（P＜0.05），其中尤以紅谷的氨基酸含量最高，以及乙酸、酒石酸等有機酸含量呈較高水平，有助于后期發酵中乙醇及酯類等風味物質的形成。

蒸煮處理后，不同品種谷物原料中的風味物質主要是醇、酸、酮和烴類化合物，其中張雜谷蒸飯的揮發性香氣成分含量最高（222.35 μg/100 g），其次是黍米和粳大米蒸飯。紅谷蒸飯的風味物質總量較低，但其酸類和酚類揮發性化合物的質量濃度最高，這為微生物的生長和繁殖提供了充足的營養，對黃酒香氣的形成有促進作用。整體而言，與其他谷物相比，紅谷作為一種新型釀酒原料在釀造方面存在一定優勢，適合進一步發酵應用。