葡聚糖硫酸鈉自由飲用與灌胃誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型的比較

茶亞飛，郭雪艷，李寶晶，李艷平，王 亭，毛曉健

(云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500)

1 材料

1.1 實驗動物C57 BL/6小鼠，♂，SPF級，體質量(20±2) g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。實驗室條件下適應性喂養1周。實驗方法及條件經云南中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會審查合格，動物倫理審查文件編號：R-06201934。

1.2 試劑0.9%氯化鈉注射液(昆明南疆制藥有限公司，批號C190521C)，DSS (3.6×104-5.0×104，MP Biomedicals公司，批號Q8378)，通用型組織固定液(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號HJ194602)。

1.3 儀器萬分之一電子天平(BT 124S北京賽多利斯儀器系統有限公司)，超純水系統(Milli-Q Academic A10，美國Millipore公司)，超低溫冰箱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

2 方法

2.1 實驗動物分組及造模方式C57 BL/6雄性小鼠60只，隨機分為正常組、3% DSS溶液自由飲用組、4% DSS溶液自由飲用組、30% DSS溶液灌胃組、40% DSS溶液灌胃組，每組12只。實驗從d 0開始造模，24 h后記為d 1，以此類推。灌胃組實驗開始時間晚于自由飲用組1 d。30%灌胃組灌胃劑量與3%自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等；40%灌胃組灌胃劑量與4%自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等。每日用量筒測量并計算自由飲用組前1 d飲用量，按以下公式計算灌胃組的灌胃體積。配制30%及40%的DSS溶液，灌胃給予相應體積的DSS溶液，每天1次。

2.2 小鼠UC模型的誘導除正常組外，各組采用對應方式給予DSS，于小鼠開始出現明顯便血時停止造模，并繼續喂養至d 10處死。自由飲用組DSS溶液每2 d更換1次。

2.3 小鼠一般情況觀察及DAI評分記錄每天記錄小鼠體質量、食量、毛色、精神狀態、糞便情況等。參考疾病活動指數(DAI)評分規則[4]對小鼠體質量、糞便性狀及大便隱血情況進行評分。

2.4 樣本采集小鼠處死后，打開腹腔，分離并剪取整段結腸，整齊擺放于濾紙上，測量結腸長度并記錄。小心剪取結腸中間部位約0.5-1.0 cm，生理鹽水迅速漂洗后置通用型組織固定液中固定過夜。隨后剪取小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺進行稱重并記錄，以臟器與體質量的比值作為臟器指數。

Study on thickness control method of steel bar protective layer in main structure of metro stations in Qingdao

2.5 結腸病理組織切片制作及評分組織固定完全后，常規脫水、包埋、切片、染色。參考文獻方法[3]，鏡下觀察結腸組織炎癥程度、隱窩損傷、炎癥深度、炎癥浸潤面積和病變深度并評分。

3 結果

3.1 小鼠死亡情況至實驗d 6，除正常組外，各組小鼠普遍可見血便，提示造模成功，開始出現小鼠死亡，40%灌胃組d 6死亡5只，d 7死亡1只，至d 10死亡率達50%；30%灌胃組d 6、8、9各死亡1只，死亡率為25%。3%自由飲用組和4%自由飲用組至實驗d 10均無小鼠死亡。

3.2 UC誘導情況自由飲用方式下，3%濃度組與4%濃度組對比：兩組小鼠體質量及DAI評分均顯著高于正常組(Fig 1A,1C)。4%濃度組體質量于d 4開始下降，3%濃度組于d 5開始下降；兩組DAI評分均于d 5達到最高值，3%濃度組總體高于4%濃度組，在d 5差異有顯著性(P<0.01)(Fig 1A,1C)。

灌胃方式下，30%濃度組與40%濃度組對比：40%濃度組體質量于d 6顯著低于30%濃度組(P<0.05)，DAI評分于d 4顯著高于30%濃度組(P<0.01)(Fig 2A,2C)。

相同劑量下，30%灌胃和3%自由飲用兩種造模方式對比：兩組小鼠體質量呈相似下降趨勢，從d 7起，灌胃組食量低于飲用組，飲用組及灌胃組DAI評分分別于d 5和d 6達到最高(Fig 3A,3B,3C)，飲用組DAI評分于d 5、8顯著高于灌胃組(P<0.05，P<0.01)(Fig 3C)。

相同劑量下，40%灌胃和4%自由飲用兩種造模方式對比：兩組小鼠體質量呈相似下降趨勢，灌胃組DAI分別于d 2、7、9顯著高于飲用組(P<0.05，P<0.01)(Fig 4A,4B,4C)。

結腸大體觀察及組織病理學觀察發現，與正常組相比，4個造模組結腸長度均顯著降低，出現不同程度的上皮結構破壞、炎性細胞浸潤、結締組織增生等病理變化，組織病理學評分均顯著升高。自由飲用方式下，4%濃度組病理學評分高于3%濃度組(P<0.01)；相同劑量下，30%灌胃組高于3%自由飲用組(P<0.01)(Fig 5A,5B)。

Fig 1 Body weight,appetite and DAI of mice under free drinking f.d.,free drinking.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

Fig 2 Body weight,appetite and DAI of mice under intragastric n=12)i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 30% DSS i.g.group

Fig 3 Body weight,appetite and DAI of mice under the same dosage,with different administration f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

Fig 4 Body weight,appetite and DAI of mice under the same dosage,with different administration n=12)f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 4% DSS f.d.group

Fig 5 Histological changes(A) and colon lengths(B) under different administration f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

從臟器指數看，與正常組相比，各造模組肝臟指數無明顯變化，胸腺指數顯著降低(P<0.01)(Fig 6)；腎臟指數中，4%自由飲用組、30%灌胃組及40%灌胃組均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)(Fig 6B)；4%自由飲用組脾臟指數顯著升高(P<0.01)(Fig 6C)。相同劑量下，30%灌胃組腎臟指數顯著高于3%自由飲用組(P<0.05)；40%灌胃組脾臟指數顯著低于4%自由飲用組(P<0.01)(Fig 6C)。自由飲用方式下，4%濃度組脾臟指數顯著高于3%濃度組(P<0.01)( Fig 6C)。

3.3 4種造模方式數據變異系數對比為比較不同濃度及不同造模方式下動物間表現的均一性，計算體質量、DAI評分、臟器指數、結腸長度和組織病理學評分的變異系數。自由飲用方式下，3%與4%濃度組體質量變異系數變化趨勢相似，4%濃度組于d 8、9略高于3%濃度組(Fig 7A)；灌胃方式下，40%濃度組體質量變異系數于d 9、10高于30%濃度45%以上(Fig 7C)。相同劑量下，從d 5起，3%自由飲用組體質量變異系數高于30%灌胃組(Fig 7E)；40%灌胃組體質量變異系數于d 10高于4%自由飲用組45%以上(Fig 7G)。

Fig 6 Organ indexes of mice under different administration n=12)f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group;△△P<0.01 vs 4% DSS f.d.group

DAI評分變異系數顯示，自由飲用方式下，3%與4%濃度組變異系數從d 2起無較大差異(Fig 7B)；灌胃方式下，d 3，40%濃度組高于30%濃度組，其余時間無較大差別(Fig 7D)。相同劑量下，3%自由飲用和30%灌胃組，前3 d自由飲用組變異系數高于灌胃組，d 4-d 10均無較大差別(Fig 7F)；4%自由飲用和40%灌胃組，d 1、2自由飲用組變異系數高于灌胃組，d 4-d 10均無較大差別(Fig 7H)。

臟器指數、結腸長度及病理學評分變異系數顯示，各飲用組胸腺指數變異系數均略高于灌胃組；各組結腸長度變異系數無較大差別。自由飲用方式下，3%濃度組病理學評分變異系數高于4%濃度組；相同劑量下，3%自由飲用和30%灌胃組病理學評分變異系數無較大差別，40%灌胃組病理學評分變異系數高于4%自由飲用組(Fig 8)。

Fig 7 Coefficient of variation of body weight and DAI under different administration free drinking;i.g.,intragastric

Fig 8 Coefficient of variation of organ index and colon lengths under different administration A：Control；B：3% DSS free drinking；C：4% DSS free drinking；D：30% DSS intragastric；E：40% DSS intragastric

4 討論

本實驗采用3%和4% DSS溶液自由飲用、30%和40% DSS溶液灌胃4種方式建立小鼠UC模型，其中，30% 灌胃組和40%灌胃組灌胃劑量分別與3%飲用組和4%飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等。通過一般體征，DAI評分、結腸長度、結腸組織病理學評分等指標評價模型復制情況，并通過上述指標值的變異系數比較各造模方式下動物間表現的均一性和模型穩定性。結果發現，4種造模方式均能成功誘導UC模型，表現為顯著降低小鼠體質量及結腸長度，升高DAI評分及結腸組織病理學評分等。其中，僅在結腸組織病理學評分方面，30%灌胃組高于3%飲用組，4%飲用組高于3%飲用組，其余指標未表現出顯著的嚴重程度差別。觀察還發現，30%灌胃組、40%灌胃組死亡率分別為25%、50%，飲用組無死亡，因此，自由飲用方式在實驗數據采集、樣本收集方面有明顯優勢。

臨床觀察發現，重癥UC病人可累及肝臟、腎臟與脾臟等器官，可能導致臟器積水，而胸腺為人體質量要免疫器官，UC狀態下受損時可發生萎縮[5]。本實驗發現，UC小鼠胸腺指數較正常小鼠顯著降低，但各造模方式間差異無顯著性；脾指數4%飲用組高于3%飲用組，40%灌胃組高于4%飲用組；30%灌胃組腎臟指數高于3%飲用組。

變異系數是評價樣本數據離散程度的重要指標。通過比較不同濃度及不同造模方式，尤其是相同劑量下自由飲用和灌胃方式各關鍵指標的變異系數發現，小鼠出現明顯便血(約實驗d 6)開始，自由飲用組體質量變異系數總體略高于灌胃組，但DAI評分變異系數無明顯差別；結腸長度變異系數在相同劑量自由飲用組和灌胃組間無較大差異；組織病理學評分變異系數3%自由飲用組略高于30%灌胃組，40%灌胃組約為4%自由飲用組的2倍。由此可見，在模型關鍵評價指標方面，灌胃組動物間表現的均一程度并不優于自由飲用組。

在DSS口服誘導急性UC模型的應用中，盡管2.0%-5.0% DSS水溶液自由飲用是推薦的最為常見的方式，但在實踐中仍受到關于模型穩定性和動物間表現均一性的質疑。已有研究對自由飲用和灌胃兩種方式進行了比較，發現3%DSS自由飲用組小鼠多項模型評價指標變異系數明顯高于灌胃組(DSS灌胃劑量始終為4 g·kg-1)[6]。本實驗室在前期實驗中發現，自由飲用下，模型組小鼠的飲水體積隨著DSS的攝入表現出顯著下降趨勢，其下降幅度明顯超過體質量降低幅度。以3%DSS溶液自由飲用為例，實驗d 5，小鼠平均飲水量約為d 0的0.33倍，平均體質量約為d 0的0.97倍，由此可見，在造模過程中，小鼠每天攝入DSS的量是動態變化的。

因此，在本實驗中，灌胃組晚于自由飲用組1 d開始給予DSS，灌胃劑量根據自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量進行調整，即30%灌胃組和40%灌胃組灌胃劑量分別與3%飲用組和4%飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等，盡可能模擬由已造成的損傷導致的飲水量和DSS實際攝入量的動態變化。結果顯示，相同劑量下，灌胃組多項指標在動物間的均一性，并未明顯優于自由飲用組。究其原因，可能由于DSS攝入量超閾值后，總攝入量上較小的差異不會帶來模型嚴重程度的顯著差異[7]，或由于模型嚴重程度取決于用于造模的DSS濃度，而非DSS總攝入量[8-9]。另外，綜合考慮造模小鼠飲水量下降幅度遠大于體質量降低幅度的現象和本次實驗的結論，我們推測，在自由飲用DSS溶液造模過程中，小鼠個體差異帶來不同程度的結腸炎癥及一般體征改變，同時導致不同程度的飲水量變化，進而影響后續DSS實際攝入劑量，比如結腸炎癥相對嚴重的小鼠，飲水量降低程度更大，相應的，攝入DSS的劑量表現為更大程度的減少，在整個造模周期中，表現出DSS攝入劑量的動態調整，轉而在一定程度上減輕了個體差異。

綜上所述，與灌胃法相比，3%和4% DSS溶液自由飲用能成功誘導小鼠UC模型，且動物間表現較均一、死亡率低、操作方便，在UC模型制備中具有明顯優勢；與3% DSS溶液自由飲用相比，4%自由飲用組各項指標未見顯著優勢，綜合考慮實驗成本，3% DSS溶液自由飲用法是小鼠急性UC模型較合適的制備方法。