基于網絡藥理學獨活寄生湯治療膝骨關節炎的分子機制

石淇允，譚旭儀，李無陰，盧 敏

(1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院藥物實驗室，河南 洛陽 471002)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝關節軟骨退行性病理改變和繼發性骨質增生為基礎的疾患，臨床上早期癥狀表現為膝關節疼痛，隨著病情進展出現膝關節活動受限，關節畸形、骨摩擦感、肌肉萎縮等[1]。流行病學調查發現KOA在中老年人群發病較多，尤其是在65歲以上人群中發病率可高達50%左右。隨著我國人口老齡化的上升趨勢，有學者預測到2050年KOA將成為第4大致殘性疾病。但病因仍不明確，多認為其發生可能與年齡、炎癥、創傷、異常應力等因素密切相關[2]。對其治療措施主要為緩解癥狀、矯正膝關節畸形、改善關節功能，延緩疾病的發展進程，提高患者的生活質量[1]。部分指南[1,3]已明確指出常用西藥如NSAIDs類藥物、鎮痛藥和SYSADOAs等短期效果顯著，但長期服用不良反應較多。

有學者[4]提出中醫藥治療KOA雖然效果顯著，但其具體作用機制和長期療效尚無較新高級別的研究證據支持。因此，探究中醫藥治療KOA的詳細作用機制，可更好的為應用中醫藥治療本病提供理論支持。課題組在前期的臨床觀察和實驗研究[5-6]均證實了獨活寄生湯能夠緩解KOA患者疼痛，抑制膝關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應，改善膝關節功能，但其具體的作用靶點和作用機制尚不明確。因此，本研究運用網絡藥理學探索獨活寄生湯治療KOA的可能的作用機制，為臨床用藥提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索關鍵詞“獨活寄生湯(獨活，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、當歸、白芍、熟地黃、甘草)”獲得其活性成分信息，并設置其口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件。

1.2 藥物作用靶點預測與疾病靶點查詢在TCMSP中進行檢索，獲取化合物的靶點，并在Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org/)UniprotKB檢索功能對各靶點人類基因簡稱進行查詢轉化，獲取獨活寄生湯中可能存在的相關基因靶點。在GeneCards數據庫(https://auth.lifemapsc.com)中以“knee osteoarthritis”為檢索詞進行檢索，獲取KOA的已知相關基因。

1.3 共同靶點的確定在相關網站(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中導入藥物作用靶點和疾病作用靶點的相關基因數據，并繪制Venny圖獲取藥物(獨活寄生湯)靶點與疾病(KOA)靶點的交集為共同靶點。

1.4 成分-靶點網絡構建將確定的藥物疾病共同靶點導入Cytoscape3.7.2(美國)構建“成分-靶點”網絡圖。使用Cytoscape3.7.2中網絡分析(Network analyzer)功能，對節點連接度(Degree)、介度(BC)和緊密度(CC)進行分析，以獲取獨活寄生湯治療KOA的主要活性成分。

1.5 蛋白相互網絡的構建將取交集后的靶點導入在線系統String11.0(http://string-db.org/)，獲得蛋白質相互作用(PPI)網絡，并將相關參數保持默認設置，篩選出網絡中的關鍵靶點。

1.6 生物通路的分析對獨活寄生湯中的有效作用靶標進行基因本體論(GO)分析與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，得到通路富集結果，將相關篩選標準設置為P<0.01，篩選出有明顯意義的通路并進行排名，將較為靠前且具有臨床意義的通路進行描述。

2 結果

2.1 獨活寄生湯的活性成分及相應靶蛋白共檢索出1 600種獨活寄生湯所含的有效活性成分，去重后得到符合標準的成分154種(Tab 1)。有效活性成分數量最多的是槲皮素，山奈酚和β-谷甾醇等化合物(Tab 2)。

Tab 1 Statistics of drug-active ingredients-target information

Tab 2 Active pharmaceutical ingredients of Duhuo Jisheng decoction

2.2 藥物靶點預測及共同靶點的確定在Uniprot 數據庫中共得到130個基因靶標。在GeneCards數據庫(https://auth.lifemapsc.com)中獲取創已知的疾病靶點1 878個。取兩者交集為共同靶點，共63個(Fig 1，Tab 3)。

Fig 1 Common target

2.3 成分-靶點與疾病靶點網絡將預測的63個蛋白構建網絡圖并分析發現共有靶蛋白的節點202個，表示相互作用的線868條，成分-靶點網絡圖節點連接度的均值為8.59，中位數為5。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃連素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素這8種成分的度值均大于所有度值的2倍中位數(Tab 4)，而度值越大說明這些成分與靶點的關聯數量越多，因此可以推測這些成分是獨活寄生湯治療KOA的主要活性物質。

Tab 3 Potential target

Tab 4 Topological parameters of main active ingredients

2.4 蛋白質相互作用網絡構建使用String數據庫獲取獨活寄生湯治療KOA相關靶標的相互作用關系，導入String數據庫，構建PPI網絡圖并進行分析發現共有節點62個，線690條，平均節點度值為22.25，度值中位數為20。IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC這7個靶點的度值均大于所有度值的2倍中位數，而度值越大說明這些成分與靶點的關聯數量越多(Fig 2)。

Fig 2 Core protein in protein interaction network diagram

2.5 GO生物學功能分析將63個潛在靶點映射到DAVID數據庫中，進行生物學功能富集，共富集到68條生物過程，篩選出獨活寄生湯治療KOA的P值最小的前42個生物學功能并繪制其氣泡圖(Fig 3)。其中P<0.01 的生物過程共有41條。

2.6 KEGG通路分析運用R語言對所有靶點進行KEGG通路富集分析共篩選出117條相關通路，對P值最小的20條通路繪制相關條形圖(Fig 4)。有91(P<0.01)條通路與獨活寄生湯治療KOA的作用相關，如：hsa05210(Apoptosis)、hsa04933(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、hsa04668(TNF signaling pathway)等基因通路。

Fig 3 GO function enrichment analysis bubble chart1：DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific;2：nuclear receptor activity;3：transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding;4：RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding;5：ubiquitin-like protein ligase binding;6 ：endopeptidase activity;7 ：steroid hormone receptor activity;8 ：steroid binding;9：ubiquitin protein ligase binding;10 activating transcription factor binding;11 integrin binding;12 ：kinase regulator activity;13：cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process;14：repressing transcription factor binding;15 ：histone deacetylase binding;16 ：cysteine-type endopeptidase activity;17 ：protein phosphatase binding;18 ：nuclear hormone receptor binding;19：protein kinase regulator activity;20 ：cysteine-type peptidase activity;21 ：phosphatase binding;22：hormone receptor binding;23：estrogen receptor binding;24：transcription cofactor binding;25：E-box binding;26 ：p53 binding;27 ：SMAD binding;28 ATPase binding;29 ：steroid hormone receptor binding;30 ：protease binding;31 ：heme binding;32 ：growth factor binding;33 ：RNA polymerase Ⅱ basal transcription factor binding;34 ：transcription coactivator binding;35：NF-kappaB binding;36 ：Hsp90 protein binding;37：cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity;38：RNA polymerase Ⅱ activating transcription factor binding;39 ：core promoter binding;40 ：glutathione binding;41 ：oligopeptide binding;42 ：MAP kinase activity.

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis bar chart1 ：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications;2 ：Fluid shear stress and atherosclerosis;3 ：Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection;4：Colorectal cancer;5 ：Apoptosis;6 ：Apoptosis - multiple species;7 ：TNF signaling pathway;8：Prostate cancer;9 ：Hepatitis B;10 ：Measles;11 ：Salmonella infection;12 ：Legionellosis;13 ：Human cytomegalovirus infection;14 ：Epstein-Barr virus infection;15 ：Prolactin signaling pathway;16 ：Proteoglycans in cancer;17：Platinum drug resistance;18：Pertussis;19：Toxoplasmosis;20：Pathogenic Escherichia coli infection

3 討論

3.1 基礎理論探析不同的學者根據KOA的發病特點，對該病從多個方面進行治療。如邢振龍等[7]從“肝、脾、腎”論治KOA；鄺高艷[5]等也曾提出“毒、瘀”是KOA的主要病機；馬浩哲等[8]提出從“虛、瘀”論治KOA；而譚旭儀等[9]總結多數醫家的理念認為“虛、毒、瘀”是KOA的主要病機，并選用獨活寄生湯治療KOA，療效顯著。獨活寄生湯[10]最早被《備急千金要方》收錄，是骨傷科常用方劑之一，該方由獨活，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、當歸、白芍、熟地黃、甘草這15味中藥組合而成，以獨活、桑寄生為君藥，具有補肝腎、祛風濕和止痹痛的臨床療效。

3.2 有效成分研究本研究運用網絡藥理學的方法，從有效成分、通路和基因蛋白等方面綜合探索評價獨活寄生湯治療KOA的作用效果。對獨活寄生湯的活性成分和KOA相應的靶標進行搜索、篩選，得到符合標準的有63個。進一步構建“藥物-成分-靶點-疾病”的網絡圖發現槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素這8種成分與治療疾病的相關性較高，結合文獻報道及實驗室研究總結[11-12]發現，這些有效成分主要與調控成骨或軟骨細胞的代謝平衡、抗氧化、改善內環境的炎癥反應等機制密切相關。如槲皮素能夠抗炎、抗氧化，也有研究[11]證實了槲皮素具有促進成骨分化的作用，同時抑制骨吸收。袁真等[12]通過實驗證實了山奈酚能夠增加骨密度，改善骨微結構。因此，獨活寄生湯治療KOA的主要有效成分可能為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素。

3.3 基因表達淺析對本研究PPI網絡分析可知，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC這幾種蛋白質超過所有度值的2倍中位數，這說明獨活寄生湯的活性成分與這些蛋白具有較高的結合活性。檢索相關文獻發現IL-6(interleukin 6)是一種內源性熱原，能夠在自身免疫性疾病或感染患者中引起發熱。這種蛋白質與多種炎癥相關疾病狀態有關，在炎性部位它被分泌到血清中，并通過白細胞介素6受體α誘導轉錄形成炎癥反應[13]。VEGFA(vascular endothelial growth factor A)是一種與血管新生有關的因子，該生長因子能夠誘導血管內皮細胞的增殖和遷移，同時與炎性指標、疾病活動及功能指標具有正相關，也可參與固有免疫調節[14]。ALB(albumin)在調節血漿膠體滲透壓中起作用，并充當多種內源性分子(包括激素，脂肪酸和代謝產物)以及外源性藥物的載體蛋白[15]，可能與KOA發生腫脹等密切相關。以上也證實了通過PPI網絡所篩選的靶點蛋白的確與KOA的發生發展密切相關。因此，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC可能為獨活寄生湯治療KOA的關鍵靶點蛋白。

3.4 生物學功能和信號通路探索從GO功能富集結果分析可知，獨活寄生湯治療KOA的潛在靶點多與炎性細胞因子的調控和骨與軟骨細胞的代謝等生物學過程相關。復習相關文獻[16]可知在正常生理情況下，炎性細胞因子(如hs-CRP、IL-6等)及骨與軟骨細胞的代謝物質(CASP3、MAPK8、MYC等)在KOA的發病過程中具有重要的影響及調節作用。而膝關節軟骨的退變、半月板及周圍軟組織損傷、下肢力線異常等可導致IL-6、hs-CRP等炎性細胞因子和MMPs、CDK4、BMP-2、CASP3、MAPK8等細胞因子含量的異常，這些細胞因子可以誘發多種凋亡誘導信號，破壞軟骨細胞的正常代謝，導致關節軟骨和半月板退變。KEGG 通路富集分析結果可知，在獨活寄生湯治療KOA的過程中主要涉及的通路可能是與代謝相關通路、腫瘤壞死因子相關通路、炎癥感染相關通路及細胞調控相關通路。如在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications中衰老和氧化作產生AGEs，AGEs作用于模式識別受體RAGE(免疫球蛋白超家族)AGE/RAGE信號可激活涉及NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多種細胞內信號通路，進而導致NF-kappaB活性。NF-kappa B促進IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子和VCAM-1、組織因子、VEGF、RAGE等多種炎性基因的表達。此外，JAK-STAT介導的和PI3K-Akt依賴的途徑是通過RAGE誘導的，RAGE又分別參與細胞增殖和凋亡[17]。而Apoptosis是典型的調節細胞凋亡的通路，通常細胞凋亡是一個通過激活半胱氨酸蛋白酶(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)消除受損或多余細胞的基因程序化過程。細胞凋亡的發生受許多相互關聯的過程控制，多種外源性化合物刺激位于細胞表面的腫瘤壞死因子(TNF)受體亞家族成員，后分別通過其特定的配體，如TNF-α、FasL或TRAIL等可導致細胞凋亡。或由于細胞內環境的改變導致DNA損傷、內質網應激、代謝應激或生長因子剝奪導致細胞色素c的釋放，激活caspase家族成員(如caspase-3和caspase-7)分泌增多，導致細胞死亡[18]。因此獨活寄生湯治療KOA可能通過調控 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway等信號通路，促使促凋亡和抗凋亡信號之間的平衡，減少炎癥細胞因子的分泌，延緩或改善關節軟骨的退變。

3.5 展望與不足本研究通過網絡藥理學和整合生物信息學方法，對獨活寄生湯治療KOA的物質基礎及其作用機制進行探析。從獨活寄生湯中共獲得有效生物活性成分154種，活性成分-靶點互作網絡中，degree值較高槲皮素、漢黃連素、黃芩素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素、山奈酚，可能在獨活寄生湯的藥理作用過程中發揮重要作用。預測的63個蛋白中可作為KOA核心治療靶點的有IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC等。這些靶點主要包含炎性細胞因子的調控和骨與軟骨細胞的代謝等生物學過程，涉及到炎性細胞因子的調控和骨與軟骨細胞的代謝等過程的有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、TNF signaling pathway 等多條信號通路。這均證實了獨活寄生湯能夠多成分、多途徑、多靶點的調控KOA的發展進程，這也為證實中藥治療疾病的科學規范化提供了新的思路。