基于網絡藥理學和分子對接分析補腎活血顆粒治療帕金森病分子機制

王 鵬，王 亮，侯曉圓，潘 宇，李紹旦，楊明會

(中國人民解放軍總醫院中醫醫學部,北京 100048)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種好發于中老年人群的中樞神經退行性疾病，主要有靜止性震顫、姿勢平衡障礙、肌僵直、抑郁、失眠等運動性和非運動性癥狀[1-2],并以黑質多巴胺能神經元進行性退變、路易小體形成為病理特征。流行病學調查顯示，我國65歲以上人群PD發病率為1 700/10萬，面對我國老齡化日益加重的趨勢，進一步推動PD的治療研究與防控勢在必行[2]。

補腎活血顆粒是解放軍總醫院中醫醫學部楊明會主任根據多年臨床經驗與療效反饋所創制，其組成為赤芍、川芎、當歸、丹參、肉蓯蓉、山茱萸、石菖蒲、蜈蚣、水蛭。補腎活血顆粒經前期臨床研究，發現該方療效穩定，能夠升高PD患者腦內多巴胺水平，降低PD患者靜息狀態下的肌張力，緩解肌僵直癥狀，同時改善患者睡眠，提高生活質量[3-6]。網絡藥理學由Hopkins于2007年提出，借助于網絡分析的方法，通過“多成分、多靶點、多途徑”研究藥物與疾病靶點之間的關系，網絡藥理學認為疾病發生的本質是網絡某個或多個節點所代表的基因或者其編碼的蛋白處于失衡狀態[7-8]。這與中醫對疾病的發生發展規律不謀而合，中醫認為疾病的本質是人體陰陽屬性出現偏差，并通過中藥復方多角度、多途徑糾正偏差。本文以網絡藥理學為研究方法，分析補腎活血顆粒調控PD的分子機制，從“疾病-基因-通路”多維度揭示PD發病規律與藥物作用途徑，有助于豐富中藥復方補腎活血顆粒科學內涵，探索研究新的藥物，推動中醫藥的傳承與發展。

1 材料與方法

1.1 補腎活血顆粒靶點查找與篩選借助于中藥系統藥理數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[9]查找補腎活血顆粒各組分的活性成分和作用靶點，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(drug-likeness，DL)>0.18為條件對查詢到的中藥成分進行ADME屬性值篩選。將篩選得到的活性成分與數據庫中的靶點一一對應，并通過uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)，將得到的靶標進行注釋。

1.2 查詢PD相關疾病靶點在GeneCards疾病數據庫中(https://www.genecards.org/)搜索關鍵詞“Parkinson disease”，查找疾病靶基因，將檢索到的靶基因根據相關度值中位數進行篩選，刪除小于中位數值的靶標。

1.3 構建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網絡通過R語言，對取得的藥物靶點與疾病靶點取交集，得到疾病-藥物共同作用靶點集合，并繪制韋恩圖。將得到的疾病-藥物共同靶點基因輸入到STRING11.0(https://string-db.org)數據庫，構建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網絡[10]，設置生物類別為“Homo Sapiens”、“interaction score”設為“highest confidence>0.9”，其余設置均為系統默認值。下載“string.tsv”文件，使用Cytoscape 3.7.1對PPI網絡文件進行編輯，并使用插件MCODE分析該網絡圖中潛在蛋白質功能模塊。

1.4 補腎活血顆粒-PD靶點功能與通路的富集分析利用Metascape在線基因注釋平臺(https://metascape.org/gp/index.html)對疾病和藥物共同作用的靶點進行功能富集分析，導入數據后，將P值設為<0.01，將獲得的結果保存后，運用office2016 Excel工具將獲得的結果進行可視化。

1.5 構建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網絡圖利用Cytoscape 3.7.1將得到的藥物-疾病共同作用靶點、活性成分和KEGG信號通路構建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網絡圖。借助軟件內置的計算工具，計算網絡節點特征值參數，將結果導出，根據度(degree)、介度(betweenness)和緊密度(closeness)篩選活性成分及蛋白質靶點，為分子對接作準備。

1.6 分子對接通過Cytoscape 3.7.1計算網絡節點特征值，篩選活性成分和蛋白質，通過PROTEIN DATA BANK、ZINC(http://zinc.docking.org)查找受體蛋白、配體小分子，并下載其3D結構，借助于AUTODOCK和PYMOL軟件進行分子對接和可視化操作。

2 結果

2.1 獲得補腎活血顆粒作用靶點通過TCMSP查詢補腎活血顆粒的化學成分，經過ADME篩選之后，其所含化學成分數量如下：赤芍29個，川芎7個，丹參65個，當歸2個，肉蓯蓉6個，山茱萸20個，石菖蒲4個，蜈蚣等為動物類藥，數據庫中尚未收錄。同時根據uniprot數據庫查詢到的蛋白質，對補腎活血顆粒藥物作用靶點進行注釋，篩去uniprot數據庫中不包含的作用靶點，獲得的各中藥靶點數目如下：赤芍121個，川芎31個，丹參666個，當歸50個，肉蓯蓉171個，山茱萸93個，石菖蒲75個，合并上述靶點刪去重復值共有靶點201個。

2.2 獲取PD疾病靶點通過Genecards數據庫共檢索到與PD相關的疾病靶點7 654個，計算“relevance score”中位數值為3.31，選擇分值大于中位數的靶點，最終得到靶點3 825個。

2.3 構建補腎活血顆粒-PD靶點PPI網絡通過R語言程序，取交集，并制作生成補腎活血顆粒-PD作用靶點韋恩圖，共得到共同靶點145個，見Fig 1。根據中藥-疾病共有的靶標逆向篩選中藥復方活性成分，刪除重復項共獲得活性成分81個，見Tab 1。將獲得的共同靶點通過STRING11.0平臺，制作PPI蛋白質-蛋白質互作網絡圖，將獲得的蛋白互作網絡圖導入至cytoscape 3.7.1中，并利用MCODE分析其潛在蛋白質功能模塊。補腎活血顆粒-帕金森病靶點PPI網絡中的module，見Fig 2。

Fig 1 Venn diagram of components of Bushen Huoxue granules-PD target

2.4 基因本體與作用通路富集分析通過Metascape在線基因注釋平臺，對獲得的藥物-疾病共同作用靶點進行功能和作用通路的富集分析。根據LogP值升序排列，取其前20位。由富集結果可以看出，補腎活血顆粒作用的靶點與PD的發病機制有密切的聯系。其中，補腎活血顆粒主要參與的生物學過程包括：對有毒物質的反應(response to toxic substance)、對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對細菌起源分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、對無機物的反應(response to inorganic substance)、細胞因子介導的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)，見Fig 3A。參與的主要通路包括PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗等，見Tab 2和Fig 3D。

Tab 1 Main components of Bushen Huoxue granules

DrugCodingMOLIDActiveingredientOB(%)DLDS34MOL007108Isocryptotanshi-none54.980.39DS35MOL007111IsotanshinoneII49.920.4DS36MOL007119MiltiononeⅠ49.680.32DS37MOL007120MiltiononeⅡ71.030.44DS38MOL007121Miltipolone36.560.37DS39MOL007122Miltirone38.760.25DS40MOL007124Neocryptotanshinoneii39.460.23DS41MOL007125Neocryptotanshinone52.490.32DS42MOL0071271-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]benzofuran-6,10,11-trione34.720.37DS43MOL007130Prolithospermicacid64.370.31DS44MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionicacid109.380.35DS45MOL007141Salvianolicacidg45.560.61DS46MOL007142Salvianolicacidj43.380.72DS47MOL007143SalvilenoneⅠ32.430.23DS48MOL007145Salviolone31.720.24DS49MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone75.390.46DS50MOL007151TanshindiolB42.670.45DS51MOL007152PrzewaquinoneE42.850.45DS52MOL007154Tanshinoneiia49.890.4DS53MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione65.260.45DS54MOL007156TanshinoneⅥ45.640.3DGDG1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75DG2MOL000449Stigmasterol43.830.76RCRRCR1MOL000098Quercetin46.430.28RCR2MOL000358Beta-sitosterol36.910.75RCR3MOL005320Arachidonate45.570.2RCR4MOL005384Suchilactone57.520.56RCR5MOL007563Yangambin57.530.81RCR6MOL008871Marckine37.050.69SZYSZY1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75SZY2MOL000449Stigmasterol43.830.76SZY3MOL001494Mandenol420.19SZY4MOL001495Ethyllinolenate46.10.2SZY5MOL002879Diop43.590.39SZY6MOL0054812,6,10,14,18-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaene33.40.24SZY7MOL005503Cornudentanone39.660.33SZY8MOL005530Hydroxygenkwanin36.470.27SZY9MOL008457Tetrahydroalstonine32.420.81SCPSCP1MOL000422kaempferol41.880.24SCP2MOL0035428-Isopentenyl-kaempferol38.040.39SCP3MOL003576(1R,3aS,4R,6aS)-1,4-bis(3,4-dime-thoxyphenyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydro-furo[4,3-c]furan52.350.62注：CS:赤芍，DS:丹參，DG:當歸，RCR:肉蓯蓉，SZY:山茱萸，SCP:石菖蒲

Fig 2 Module of Bushen Huoxue granules-PD target PPI network

Fig 3 Enrichment analysis of potential targets of main components of Bushen Huoxue granulesNotes:A：GO-BP；B:GO-CC；C：GO-MF；D:KEGG

Tab 2 Enrichment results of Bushen Huoxue granules treatment of PD target pathway

補腎活血顆粒靶點治療PD的功能主要富集于蛋白激酶結合(protein kinase binding)、激酶結合(kinase binding)、蛋白質同聚活性(protein homodimerization activity)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)，見Fig 3C。

Fig 4 Schematic diagram of molecular docking of interaction between quercetin and PTGS2 (1PXX)

2.5 構建補腎活血顆粒-PD靶點-作用通路網絡圖利用Cytoscape 3.7.1構建“補腎活血顆粒-PD靶點-通路網絡圖”。使用Cytoscape 3.7.1內置分析功能——Network analyzer分析Fig 5網絡節點特征參數值，確定核心成分與核心靶點，并以連接度值的大小取其前5位，見Tab 3。

Tab 3 Network node characteristic parameters of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

由Tab 3網絡節點特征值參數可知，槲皮素連接度為98、介度為0.33、緊密度為0.55，是補腎活血顆粒主要活性成分，其他活性成分有木犀草素(連接度為43、介度為0.07、緊密度為0.44)、山柰酚(連接度為36、介度為0.05、緊密度為0.41)、丹參酮(連接度為27、介度為0.04、緊密度為0.41)。

PTGS2連接度為77、介度為0.24、緊密度為0.54，是補腎活血顆粒作用的主要靶點，此外，PTGS1(連接度為45、介度為0.07、緊密度為0.47)、SCN5A(連接度為44、介度為0.04、緊密度為0.45)、ADRB2(連接度為41、介度為0.03、緊密度為0.45)、CHRM1(連接度為、介度為0.02、緊密度為0.39)亦是補腎活血顆粒作用的重要靶點，詳見Tab 4。

Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

2.6 分子對接通過得到的網絡節點特征參數，發現槲皮素連接度最高(連接度為98)是補腎活血顆粒主要活血性成分，PTGS2為主要作用靶點(連接度為77)，因此以槲皮素作為配體小分子，PTGS2為受體蛋白進行分子對接。借助于PROTEIN DATA BANK查找受體蛋白的編碼為1PXX，下載其3 d結構，見Fig 4A；并借由ZINC(http://zinc.docking.org)查找配體小分子槲皮素，下載其3 d結構，見Fig 4B。使用AUTODOCK軟件對受體蛋白和配體小分子進行分子對接，導出其對接文件，運用pymol將對接結果可視化，得到分子對接模式圖，見Fig 4C。從對接結果和分子模式圖中，可以發現槲皮素可以結合于1PXX蛋白質，主要通過GLU-67、GLN-54兩個氨基酸殘基與槲皮素發生H鍵作用，氫鍵的結合能為-2.49。

3 討論

PD又稱震顫麻痹癥，中醫學雖無此病名，卻有“顫證”、“震顫”諸癥狀為病名載之。古代醫家認為該病屬本虛標實之證，以肝腎陰虛、氣血衰弱為發病機制，臨床以風邪盛實之狀為特點，誠如孫一奎于《赤水玄珠·顫振門》中記載:“顫振者，人病手足搖動，如抖擻之狀，筋脈約束不住，而莫能任持，風之象也。”楊明會教授在繼承前人發病觀的基礎上，認為腎虛血瘀亦是顫證發生的關鍵，皆因腎乃水臟，木水互滋相生，腎虛則精虧水少，充養不足，引動肝風，久之化火生痰，阻滯經絡血脈，瘀滯之象從生。補腎活血顆粒方以丹參、山茱萸、肉蓯蓉為君藥，填精溫陽、通行血脈；當歸、川芎、赤芍為臣藥，活血祛瘀；石菖蒲為佐藥，開隧竅逐瘀、除神志迷塞；水蛭、蜈蚣通行經脈，為使藥。全方通補兼施，益腎活血并進，共奏補腎活血、益精填髓、通行血脈之功。

本研究發現，補腎活血顆粒治療PD的主要靶點有PTGS2、PTGS1、SCN5A、ADRB2和CHRM1等。PTGS2，是多表達于中樞神經系統的重要炎性介質，PTGS1亦炎癥反應介質之一，PTGS2水平的高表達與神經元損傷、認知障礙具有一定的聯系[11]；ADRB2能夠與細胞膜上的離子通道受體形成復合物，從而調控離子通道，這與PD發病機制中線粒體功能障礙發病機制有一定聯系[12];CHRM1可與乙酰膽堿進行結合，能夠保護乙酰膽堿神經元，從而能夠影響人體的睡眠、記憶和感覺運動等功能，而PD非運動癥狀中伴隨有失眠、健忘等[13]。通路富集結果中如PI3K/AKT信號通路可影響神經元的發育，并能影響大腦黑質多巴胺的含量[14]；Toll樣受體信號通路中的TLR4是重要的免疫炎癥受體，參與到神經細胞損傷和破壞血腦屏障等發病機制進程中[15]。

通過PPI網絡節點特征值參數，發現主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮等。研究表明，槲皮素能夠調節IKKα/NF-κB信號通路，具有抑制神經炎癥反應的作用[16]；木犀草素可減少α突觸核蛋白聚集水平，降低活性氧(ROS)的水平，同時還能抑制神經炎性反應，減輕神經細胞凋亡，保護神經功能；山柰酚可保護神經元免受β淀粉樣蛋白的損傷；丹參酮具有抗炎、抗氧化和保護神經元的作用，對PD的治療有一定價值，還可減輕細胞凋亡和保護線粒體膜的穩定性[17-18]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學從分子層面進行研究，發現補腎活血顆粒有不同的活性成分，能夠參與到不同的生物學進程中去，從多層次、多環節發揮其對PD的作用機制，為臨床治療PD提供了新思路與新參考，同時為后續進一步實驗驗證補腎活血顆粒作用機制奠定了基礎。