紅景天苷調控PI3K/Akt信號通路對永久性腦缺血大鼠的保護作用

黃嘉慧，趙春蕊，聶婧雯，羅 銳，黃私迎，孫春曉，楊澤霖，應 雄，洪桂祝，賴文芳

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦卒中作為世界死亡和傷殘對第二原因，具有高死亡率、致殘率和發病率。因中風傷殘或死亡的人從1990年到2016年翻了一倍，每年新增病例有1 300多萬人。早在2017年齡標準化中風就超過了心臟病，肺癌等其他疾病成為了中國年齡標準化死亡原因的榜首[1-2]。由于多種因素導致局部腦組織血供減少或完全中斷，腦卒中導致局灶性組織梗死及相應的突發性神經功能缺損多急性缺血性腦卒中占中國腦卒中的69.6%-70.8%[3-4]。然而幸存者仍然有著極高的致殘風險，需要短期或長期的康復，造成了巨大的人力和經濟負擔[5]。

紅景天為我國傳統中草藥，有益氣活血，通脈平喘之功效，其中，紅景天苷( salidroside,Sal) 是紅景天的主要有效成分，具有增強記憶、改善心腦血管系統功能等多種藥理作用[6]。本團隊致力于紅景天苷藥物研發，前期研究發現，紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(tMCAO)的神經保護作用及其機制，闡明紅景天苷能夠降低梗死面積，修復神經功能損傷，對tMCAO大鼠具有神經保護作用[7-13]。由于新藥的研發在臨床前藥效學研究階段,需要兩種以上動物模型的研究，課題組也研究了紅景天苷對永久性腦缺血(pMCAO)大鼠的作用，并明確紅景天苷能夠降低pMCAO大鼠腦梗死體積[8]，但對pMCAO大鼠作用的具體機制尚不明確，因此，本文將進一步探索紅景天苷對pMCAO大鼠的神經保護機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物70只SPF級雄性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司購入)，體質量(220±20)g，按照SPF級規范，恒定濕度和溫度，不禁食，不禁水，適應性飼養(福建中醫藥大學實驗動物中心飼養)。上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：2015000509563，許可證號：SCXK(滬)2015-0002；福建中醫藥大學實驗動物中心許可證號：SYXK(閩)2015-0005。

1.2 藥品與主要試劑紅景天苷(福建中醫藥大學，純度98%)；β-actin抗體(貨號：H015)，來自碧云天生物技術有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG(貨號：ab7064)、TRITC標記羊抗兔IgG(貨號：ab6718)、NeuN抗體(貨號：AB51005)，均來自英國Abcam公司；SYBR Select Master Mix(美國Applied Biosystem公司，批號：4472908)；NF-κB p50抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-166588)。

1.3 實驗儀器倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司；7900H-PCR儀，美國Applied Biosystems公司；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統，美國Biorad公司；ND2000C紫外可見分光光度計，美國Thermo公司；3600AAA尼龍線栓，廣州佳靈生物技術有限公司；Nikon DS-Ril生物數碼顯微鏡，尼康儀器有限公司。

2 方法

2.1 pMCAO模型大鼠制作本動物實驗參照Zea Longa的方法進行pMCAO模型大鼠的制備。禁食SD大鼠12 h后，使用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉，于頸部沿中線切開，分離頸總動脈，頸外動脈、頸內動脈，選擇頸總動脈開口并用線栓插入，上行至Willis環，至稍感阻力，固定線栓，按要求消毒縫合切口。假手術組不插入線栓，其余手術操作同上。待大鼠清醒參照Longa法[14]對其進行神經功能評分與神經功能缺損評價：0分為無神經損傷；1分為無法完全伸出缺血側前爪；2分為向缺血側轉圈；3分為向缺血側傾斜；4分為失去知覺計或喪失自主行走能力，評分在2-3分視為模型成功，可用于后續實驗。

2.2 實驗動物分組和給藥30只大鼠隨機分為假手術組(sham組)、模型組(pMCAO組)、給藥組(pMCAO+Sal組)，大鼠采用線栓法造模成功后，照常飼養，對sham組和pMCAO組大鼠按照10 mL·kg-1·d-1腹腔注射0.9%生理鹽水，pMCAO+Sal組按照50 mg·kg-1·d-1腹腔注射紅景天苷[15]，給藥1 d后，取材。

40只大鼠隨機分為假手術組(sham組)、模型組(pMCAO組)、給藥組(pMCAO+Sal組)、抑制劑組(pMCAO+Sal+LY組)；調節腦立體定位儀進行定位左側腦室：以前囟為坐標原點，頭尾方向向后移動0.9 mm，左側移動1.5 mm，深度為3.5 mm，注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制劑 LY294002后(LY294002用含25% DMSO的PBS溶解)，側腦室注射30 min后，制備pMCAO模型，1 h后，腹腔注射生理鹽水或紅景天苷，給藥1 d后取材。

2.3 Western blot分析腦組織中蛋白的表達水平提取大鼠缺血側大腦總蛋白進行蛋白濃度的測定，用SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離后，轉移凝膠上的蛋白至PVDF膜上。5%BSA封閉2 h，加入一抗，NeuN稀釋比例為1 ∶800，NF-κB p50稀釋比例為1 ∶800，β-actin稀釋比例為1 ∶3 000，4 ℃搖床孵育12 h。使用TBST洗滌3次，每次10 min后，于按比例稀釋的二抗中室溫孵育2 h，使用TBST洗滌3次，每次10 min。按比例配置ECL顯色劑，行ECL顯色劑經凝膠成像分析系統顯影，分析目標條帶的灰度值。

2.4 RT-qPCR 檢測IL-6，TNF-αmRNA表達水平提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測各基因的表達。參照GenBank中大鼠 IL-6、TNF-α的引物序列，IL-6 引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列 5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR 擴增片段長度為 129 bp；TNF-α 引 物 上 游 序 列 5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′；下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR 擴增片段長度為 149 bp;GAPDH 引物上游序列 5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列 5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR 擴增片段長度為96 bp。

2.5 免疫組織化學(IHC)染色測定腦組織中NeuN 的表達大鼠給藥1 d后，2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，于心尖處插入灌注針至左心室，并迅速剪開右心耳以形成灌注液排除通道，從左心室快速灌注生理鹽水250 mL后，再灌注4%多聚甲醛2 h，然后迅速取腦組織置4%多聚甲醛中固定24 h。使用腦膜將全腦冠狀均等分成6片，進行脫水、石蠟包埋及切片。腦組織切片進行熒光染色后使用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，記錄結果，并用ZEN LIGHT軟件檢測熒光信號。

3 結果

3.1 紅景天苷對pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN的作用免疫熒光染色結果顯示，與sham組比較，pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN表達明顯減低，經Sal作用后，其能夠明顯促進pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN表達量，且差異具有統計學意義(P<0.05)；同時，Western blot結果表明，與sham組比較，pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN蛋白表達降低，經Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN蛋白明顯增多，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 1。

3.2 紅景天苷對pMCAO大鼠缺血側腦組織Akt的作用Western blot結果表明，與sham組比較，pMCAO組大鼠缺血側腦組織Akt蛋白的磷酸化水平表達明顯減少，經Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側腦組織Akt蛋白磷酸化水平明顯升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 2，同時，Sal對pMCAO大鼠缺血側腦組織總Akt的蛋白沒有影響。

Fig 1 Effect of salidroside on NeuN immunofluorescence expression and protein in pMCAO rats*P<0.05,**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 2 Effects of salidroside on Akt in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO

3.3 紅景天苷對pMCAO大鼠缺血側腦組織核蛋白NF-κB p50和炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達影響與sham組相比，pMCAO組核蛋白NF-κB p50，及炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA表達明顯增加，經Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側腦組織核蛋白NF-κB p50、IL-6和TNF-α mRNA表達明顯降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 3。

3.4 紅景天苷對pMCAO大鼠缺血側腦組織NeuN及炎癥因子的影響本實驗通過側腦室注射PI3K抑制劑LY294002后30 min，pMCAO造模，檢測相關蛋白及炎癥因子的表達水平。與pMCAO+Sal組比較，pMCAO+Sal+LY組p-Akt蛋白表達明顯受抑制，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 4，表明LY294002能夠抑制Sal所引起的Akt蛋白磷酸化水平；同時，檢測缺血側腦組織NeuN蛋白、核蛋白NF-κB p50和炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達，研究結果顯示，與pMCAO+Sal組比較，pMCAO+Sal+LY組，其NeuN蛋白降低，TNF-α和IL-6的mRNA表達明顯增加，核蛋白p50表達上調，差異均具有統計學意義，見Fig 5。

Fig 3 Effect of salidroside on nucleoprotein NF-κB p50,IL-6 and TNF-α mRNA in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 4 Effect of salidroside on Akt protein in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

Fig 5 Effects of salidroside on NeuN protein,nucleoprotein NF-κB p50 and inflammatory markers in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

4 討論

PI3K/Akt通路作為一條經典且作用廣泛的信號途徑，涉及氧化應激、炎癥反應、細胞增殖和凋亡等諸多方面。課題組前期研究發現，Sal能有效減少pMCAO大鼠大腦梗死體積[8]，抑制炎癥因子，故本實驗通過抑制PI3K來研究PI3K/Akt信號通路及對Sal作用的影響，深入探討Sal的藥理的分子作用機制。目前，PI3K抑制劑包括單純PI3K抑制劑(Pan-PI3K Inhibitors)和選擇性PI3K抑制劑Selective PI3K Inhibitors)兩種。本實驗采用廣泛應用的LY294002進行實驗。LY294002是一種分子量大小為307.34的化合物，屬于單純PI3K抑制劑，可同時抑制p110α、p110β和p110δ 3個亞型，使下游多條信號通路失活，已廣泛用于腦缺血損傷機制研究。本實驗通過側腦室注射PI3K抑制劑LY294002l對pMCAO大鼠腦內PI3K/Akt通路阻斷后，進而研究其對Sal的神經保護作用的影響。研究發現，在pMCAO大鼠中，Sal可促進pMCAO大鼠缺血側腦組織Akt蛋白的磷酸化水平，增加NeuN蛋白表達，抑制核蛋白NF-κB p50的核轉錄水平，抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA水平，表明Sal可能通過激活PI3K/Akt通路，抑制NF-κB p50的核轉錄，進而抑制炎癥因子表達，上調神經元標志物NeuN蛋白表達。通過側腦室注射PI3K抑制劑LY294002后，在進一步的實驗中發現，PI3K抑制劑LY294002能夠逆轉以上Sal的干預作用，表明在pMCAO模型中，Sal的神經保護作用機制與激活PI3K/Akt信號通路，抑制NF-κB核轉錄與炎癥因子的表達，上調神經元標志物NeuN蛋白表達有關。

綜上，Sal能夠通過調控PI3K/AKT信號通路，抑制NF-κB p50核轉錄水平，進而抑制炎癥因子，進而對pMCAO模型大鼠具有神經保護的作用。