Exendin-4對Ⅰ型糖尿病小鼠內皮祖細胞功能及AKT/eNOS信號通路的影響

帥青云，涂 強，黃小川，付 杰，曹 政

(1.湖北醫藥學院，2.十堰市太和醫院，湖北 十堰 442000)

缺血性血管疾病是糖尿病最常見的并發癥之一，血管內皮損傷和血管生成能力障礙在糖尿病缺血性血管疾病的發生發展中起著重要作用。因此，研究如何修復受損的血管內皮，改善血管生成能力是防治糖尿病缺血性血管疾病的重要策略。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是骨髓和外周血內皮細胞的前體細胞，在血管內皮損傷修復和血管生成中起重要作用。當血管發生損傷時，EPCs可以從骨髓動員到外周血循環，通過在損傷和缺血部位的遷移和黏附，參與血管損傷修復和血管生成[1-2]。而糖尿病患者EPCs數量和功能明顯降低，導致嚴重的缺血性血管病變[3]。因此，積極尋求改善糖尿病EPCs功能的有效手段是逆轉糖尿病缺血性血管病變的關鍵環節。

Exendin-4作為胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)激動劑，可促進胰島素的分泌，目前主要用于2型糖尿病的臨床治療[4]。新近研究表明，除了胰島素調節作用外，Exendin-4還具有抗炎、調節血脂、降低體質量等心血管保護作用[5-6]。然而，Exendin-4能否調控糖尿病EPCs功能活性，促進損傷血管內皮的修復，目前尚不明確。因此，本研究擬觀察Exendin-4對Ⅰ型糖尿病小鼠骨髓來源的EPCs增殖、遷移、黏附及衰老的影響，并初步探討其可能機制，以期為糖尿病血管并發癥的防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 小鼠淋巴細胞分離液(批號：C-10831)購自美國Sigma公司；EGM-2培養基(批號：C-22121)購自美國PromoCell公司；人纖維連接蛋白(批號：F0895)購自美國Sigma公司；人重組血管內皮生長因子(批號：100-20)購自美國PeproTech公司；鏈脲佐菌素(批號：572201)購自美國Millipore公司；Exendin-4(批號：HY-13443)、Exendin-9-39(批號：HY-P0264)及MK-2206(批號：HY-10358)均購于美國MedChemExpress公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、β-actin抗體及細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購自碧云天公司;抗AKT抗體、抗磷酸化AKT (p-AKT)抗體，抗eNOS 抗體、抗磷酸化eNOS (p-eNOS)抗體購自美國Immunoway公司;其它試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.1.2實驗動物及處理 雄性8周齡C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK-京-2016-0006)，研究方案經湖北醫藥學院動物管理委員會批準。選取8周齡C57BL/6J雄性小鼠，連續5 d腹腔注射鏈脲佐菌素(50 mg·kg-1·d-1)構建Ⅰ型糖尿病小鼠模型，對照組小鼠給與0.1 mL檸檬酸鈉溶液腹腔內注射,造模期間每周至少測定3次血糖。隨機血糖>300 mg·d-1被確診為糖尿病小鼠。糖尿病小鼠建模成功6個月后用于后續骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMNCs)分離，并誘導分化為EPCs。

1.2 實驗方法

1.2.1EPCs的分離和培養 采用密度梯度離心法分別從對照組和糖尿病組小鼠中獲得BMNCs,接種至預先涂有5 mg·L-1人纖維連接蛋白，并含有血管內皮生長因子(VEGF-A)、成纖維細胞生長因子(b-FGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、表皮生長因子(EGF)、5%胎牛血清和1%雙抗的EGM-2培養基中進行細胞培養。培養4 d后，采用無菌PBS去除未貼壁細胞，即得到骨髓來源的EPCs。

1.2.2克隆形成實驗 將對照組和糖尿病組小鼠BMNCs接種于24孔板(2×105個細胞/孔)中，加入EGM-2培養基中培養，糖尿病組細胞加入或不加入Exindin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)培養7 d。用PBS緩沖液清洗細胞3次，于普通倒置顯微鏡下拍照計數。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 將BMNCs接種于96孔板中(2×104個細胞/孔)，在37 ℃ EGM-2培養基中加入或不加入Exindin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)培養7 d,然后將含有CCK-8的100 μL新鮮培養基添加到每個孔中，并在37 ℃下孵育1 h。用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度值(以空白孔進行調零)。

1.2.4細胞遷移實驗 將培養d 7的EPCs消化重懸并計數，按照5×104個EPCs接種到Boyden小室的上室，小室下室加入700 μL EGM-2培養基(含或不含50 μg·L-1VEGF)。37 ℃培養24 h后，取出Boyden小室，輕輕擦拭掉上室未遷移的細胞，于4%多聚甲醛中固定10 min，DAPI染色，熒光顯微鏡下計數。

1.2.5細胞黏附實驗 胰酶消化培養至d 7的EPCs，按照3×105個EPCs接種于預先包被人纖維粘連蛋白的12孔板中，于5%的CO2在37 ℃下培養5 h后棄掉未黏附細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色后于倒置顯微鏡下計數。

1.2.6細胞衰老實驗 Exendin-4處理EPCs 7 d后，棄除細胞培養基，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，加入碧云天生產的β-半乳糖苷酶染色液，放置37 ℃不含CO2的溫箱中孵育24 h后于普通顯微鏡下觀察拍照，被染成藍色的即為衰老細胞。

1.2.7Western blot檢測p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白表達 分別收集各組EPCs，預冷PBS漂洗2次，加入RIPA緩沖液裂解細胞，在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min，收集細胞蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，用SDS-PAGE分離膠分離蛋白，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，加入封閉液室溫封閉1 h，Western blot洗滌液漂洗膜2 min，別加入稀釋好的β-actin(1 ∶1 000;AA128；碧云天)、p-AKT(1 ∶1 000；YP0006；Immunoway)、AKT(1 ∶1 000；YT0185；Immunoway)，p-eNOS(1 ∶1 000；YP1238；Immunoway)和eNOS(1 ∶1 000；YM3164；Immunoway)一抗4 ℃孵育過夜，Western blot洗滌液充分漂洗3次，10 min/次，然后加入HRP標記的二抗室溫孵育1.5 h，Western blot洗滌液充分漂洗3次，10 min/次，用ECL顯色液進行顯色。利用ImageJ軟件對目的條帶進行分析(以β-actin為內參)。

2 結果

2.1 Exendin-4上調Ⅰ型糖尿病小鼠克隆形成及增殖能力為探討Exendin-4對糖尿病小鼠EPCs克隆形成及增殖能力的影響,本研究將糖尿病小鼠BMNCs與含或不含Exendin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)的EGM-2培養基在37 ℃下培養7 d后分別檢測其克隆形成能力及增殖能力。克隆形成實驗及CCK-8分析表明，Exendin-4以劑量依賴性改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs增殖能力，其中Exendin-4以10 μmol·L-1的濃度作用最為顯著(Fig 1，P<0.01)，而高濃度的的Exendin-4(25 μmol·L-1)可明顯抑制細胞增殖，甚至低于糖尿病組(Fig 1，P<0.01)，這可能與過高濃度的Exendin-4導致細胞死亡相關。

2.2 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs遷移能力采用Transwell小室法觀察10 μmol·L-1Exendin-4處理對糖尿病小鼠EPCs體外遷移能力的影響。與糖尿病組相比，Exendin-4組EPCs體外的遷移能力明顯改善(Fig 2，P<0.05)。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種重要的促血管生成活性的生長因子,可增加血管通透性,促進細胞遷移,對EPCs的生長也存在重要作用，在本研究中，我們也發現VEGF可進一步增強EPCs遷移能力，這與既往相關報道一致[7]。

Fig 1 Effects of Exendin-4 in different concentrations on colony-formation and proliferation ability of EPCs n=4 )A：NDM；B：DM；C：DM+Ex-4(1 μmol·L-1)；D：DM+Ex-4(5 μmol·L-1)；E：DM+Ex-4(10 μmol·L-1);F:DM+Ex-4(25 μmol·L-1).**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05,##P<0.01 vs DM-EPCs

Fig 2 Representative photographs and quantification analysis of migratory activity of EPCs n=4)**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05 vs DM-EPCs

2.3 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs黏附能力與正常對照組小鼠相比，糖尿病組小鼠EPCs黏附能力明顯下降(Fig 3，P<0.01)；與糖尿病組EPCs相比，Exendin-4組EPCs體外黏附能力提高(Fig 3，P<0.05)。

Fig 3 Representative photographs and quantification analysis of adhension of EPCs n=4)**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05 vs DM-EPCs

2.4 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs衰老采用β-半乳糖甘酶染色法觀察EPCs衰老的變化。與糖尿病組EPCs相比，Exendin-4處理組EPCs衰老明顯減少(Fig 4，P<0.01)。

2.5 Exendin-4對糖尿病小鼠EPCs GLP-1R/Akt/eNOS信號通路的調控作用Western blot結果分析顯示，Exendin-4處理可顯著增加糖尿病小鼠EPCs AKT/eNOS蛋白磷酸化水平(Fig 5，P<0.05或P<0.01)。為進一步研究GLP-1R/AKT/eNOS信號通路是否參與Exendin-4對糖尿病小鼠EPCs功能的調控作用，在Exendin-4作用前，本實驗進一步使用GLP-1R特異性抑制劑Exendin-9-39(5 μmol·L-1)和AKT特異性抑制劑MK-2206(3 μmol·L-1)預處理EPCs。如Fig 5所示，Exendin-9-39和AKT特異性抑制劑MK-2206預處理可逆轉Exendin-4促磷酸化效應(Fig 5，P<0.05或P<0.01)。這些結果提示，Exendin-4可能通過激活GLP-1R/AKT/eNOS信號轉導通路發揮作用。

Fig 4 Representative photographs and quantification analysis of senescence of EPCs ( n=4 )**P<0.01 vs NDM-EPCs;##P<0.01 vs DM-EPCs

Fig 5 GLP-1R inhibitor Exendin-9-39 and AKT inhibitor MK-2206 inhibited Exendin-4 induced AKT and eNOS phosphorylation in DM-EPCs n=3 )1：NDM；2：DM；3：DM+Ex-4；4：DM+Ex-4+Ex(9-39)；5：DM+Ex-4+MK-2206.**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05,##P<0.01 vs DM-EPCs;△P<0.05,△△P<0.01 vs DM+Exendin-4-EPCs

3 討論

血管內皮損傷修復及血管生成能力障礙是糖尿病缺血性血管病變的重要發病環節，恢復和促進血管生成能力是防治糖尿病缺血性血管疾病的關鍵手段。骨髓來源的EPCs是促進血管內皮損傷修復及血管生成的重要因素之一，其數量和功能與糖尿病血管生成密切相關[8]。因此，積極尋求改善糖尿病EPCs功能和數量的有效手段是目前亟待解決的關鍵問題。

近年來，GLP-1和GLP-1R介導的途徑已成為糖尿病治療的潛在靶點。例如，GLP-1R分布于小鼠的心內膜、血管內皮、平滑肌細胞和心肌細胞中[9]。GLP-1/GLP-1R也被報道具有心血管保護作用和改善2型糖尿病患者內皮細胞功能障礙的潛力[10-11]。Exendin-4作為一種GLP-1R受體激動劑，具有較長的半衰期，能直接保護心血管系統而不受高血糖的影響，不僅能通過調節糖、脂代謝降低心血管疾病的風險，而且直接作用于血管內皮[12-13]。然而，Exendin-4在EPCs調控中的應用尚未見報道。在本研究中，我們發現Exendin-4可以促進糖尿病小鼠EPCs的增殖、遷移和黏附能力，同時抑制細胞衰老，由此提示Exendin-4的心血管保護作用部分可能是通過改善EPCs的功能活性實現的，但具體機制尚不明確。

既往研究表明，AKT/eNOS信號通路參與了EPCs的分化和缺血損傷[14-15]。高濃度葡萄糖通過調控AKT途徑影響EPCs增殖、遷移和管腔形成能力[16]。eNOS是調節內源性NO生成的關鍵酶，受PI3K/AKT信號通路的調控[17]，因此，我們推測Exendin-4很有可能通過與GLP-1R受體結合，進而調控下游AKT/eNOS信號通路從而參與EPCs增殖、遷移、黏附和細胞衰老能力。為了進一步驗證我們的假設，我們接下來檢測了AKT/eNOS的磷酸化水平。結果顯示，糖尿病小鼠EPCs AKT/eNOS磷酸化水平明顯下降，Exendin-4處理可明顯上調AKT/eNOS磷酸化水平，此外，GLP-1R抑制劑Exendin-9-39和AKT抑制劑MK-2206可阻斷Exendin-4的促磷酸化效應，由此提示Exendin-4可能通過AKT/eNOS途徑調控EPCs功能活性進而影響糖尿病血管內皮損傷修復及血管生成能力。

本研究也存在一定的局限性，首先僅在體外細胞實驗觀察了Exendin-4處理對糖尿病小鼠EPCs功能的影響，后續有待進一步通過動物實驗及臨床實驗探討Exendin-4對糖尿病EPCs功能活性的調控作用。其次，對于Exendin-4調控糖尿病EPCs功能活性的機制，僅檢測了對AKT/eNOS信號通路的影響，但未進行進一步深入的探討。

綜上所述，本研究顯示Exendin-4可調控糖尿病小鼠骨髓來源的EPCs功能活性，GLP-1R/AKT/eNOS信號通路可能參與了Exendin-4對糖尿病EPCs功能活性的調控。本研究為進一步發揮Exendin-4在糖尿病血管并發癥的防治方面提供了新的理論依據。