紅景天苷調(diào)控KLF4/eNOS信號(hào)抑制Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用

何 麗，涂夢(mèng)欣，黃 梅，彭劍青，姜 豐，沈祥春，張彥燕

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室、2.天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

研究表明，血管內(nèi)皮功能損傷介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的改變，其中內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是影響其生物學(xué)功能的主要環(huán)節(jié)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞在特殊生理或病理?xiàng)l件下，可逐漸丟失原有的內(nèi)皮表型，表現(xiàn)為內(nèi)皮標(biāo)志物如CD31、血管內(nèi)皮黏蛋白(VE-cadherin)等的表達(dá)減少，同時(shí)獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，表達(dá)如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)等標(biāo)志物的上調(diào)，細(xì)胞的增殖、遷移與分泌能力進(jìn)一步增強(qiáng)，此過程稱之為EndMT[2]，是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病情推進(jìn)演變的重要病理過程[3]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性降低及一氧化氮(NO)生物利用度的下調(diào)，已成為內(nèi)皮功能損傷的顯著特征[4]。eNOS為內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的關(guān)鍵酶，在EndMT介導(dǎo)的AS疾病中涉及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)變化[5]，故eNOS/NO信號(hào)軸參與EndMT過程中對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)通過與特定DNA序列特異性結(jié)合，對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)過程起到調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Krüpple樣因子(Krüpple like factors，KLFs)為參與調(diào)節(jié)重要生命過程的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其中Krüpple樣因子4(Krüpple like factor 4，KLF4)具有調(diào)控細(xì)胞增殖、表型差異及重塑細(xì)胞骨架等作用[6,7]。因此，本研究擬基于KLF4/eNOS信號(hào)開展內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究工作。

紅景天苷(salidroside，SAL)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬植物紅景天的主要有效成分。研究表明，SAL可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，具有明確保護(hù)心血管系統(tǒng)的藥理作用[8-10]。前期研究表明，紅景天苷可上調(diào)Hcy 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化信號(hào)Nrf2 的表達(dá)，改善內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提示SAL具有潛在保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[11]。本研究基于KLF4/eNOS信號(hào)途徑，分析SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，以期為中藥藥效成分紅景天苷的血管藥理學(xué)活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司，批號(hào)19195。

1.2 試劑紅景天苷購(gòu)自西亞化學(xué)工業(yè)有限公司(純度≥98%，批號(hào)：B19208)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞凍存液購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司(批號(hào)：26219、19671)；VE-cadherin、α-SMA、KLF4、eNOS抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(批號(hào)分別為：#2500、#19245、#4038、#9572)；GAPDH抗體購(gòu)自Bioworld公司(批號(hào)：MB001)；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(批號(hào)：P0010)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millpore公司(批號(hào)：1829501)；siRNA由上海吉瑪基因科技有限公司提供(對(duì)照siRNA正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。KLF4 siRNA正義：5′-GGACUUUAUUCUCUCCAAUTT-3′，反義：5′-AUUGGAGAGAAUAAAGUCCTT-3′)。

1.3 儀器DMi1倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；170-3930型垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)于含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的雙抗、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液及傳代。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用siRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的沉默。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000，配制siRNA-lipofectamin復(fù)合物，細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)24 h，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2.3 細(xì)胞處理與分組第一部分實(shí)驗(yàn)研究SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model，1 mmol·L-1Hcy)、SAL低劑量組(1 mmol·L-1Hcy +10 μmol·L-1SAL)、SAL高劑量組(1 mmol·L-1Hcy +50 μmol·L-1SAL)。各給藥組以SAL預(yù)孵育2 h后，加入Hcy共孵育48 h誘導(dǎo)EndMT。第二部分實(shí)驗(yàn)通過siRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的沉默，基于KLF4/eNOS信號(hào)分析SAL抑制EndMT的分子機(jī)制。分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model，1 mmol·L-1Hcy)、SAL組(1 mmol·L-1Hcy +50 μmol·L-1SAL)、siKLF4組(1 mmol·L-1Hcy+siKLF4)、siKLF4+SAL共給藥組(1 mmol·L-1Hcy+siKLF4+50 μmol·L-1SAL)。轉(zhuǎn)染處理方法按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行，各處理組預(yù)孵育2 h后給予Hcy共孵育48 h復(fù)制EndMT。

2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)的蛋白表達(dá)收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(PMSF ∶RIPA=1 ∶99)于冰浴提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以30 μg的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。濕轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。分別加入一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h。1×TBST洗膜后，增強(qiáng)型ECL液暗室顯影。Image Lab 5.1 軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將細(xì)胞接種于六孔板，按2.3項(xiàng)下第一部分實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，采用10 μL移液槍垂直劃痕，PBS洗滌后采用無(wú)血清培養(yǎng)基給藥處理，倒置顯微鏡下拍照。隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，分析SAL對(duì)細(xì)胞遷移力的影響。遷移率/%=(0 h劃痕距離平均值-12 h劃痕距離平均值)/0 h劃痕距離平均值×100%。

2.6 試劑盒檢測(cè)NO的含量將HUVECs接種于培養(yǎng)板，按2.3項(xiàng)下第一部分實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，依試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量。

2.7 KLF4 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)將HUVECs接種于六孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為60%左右，按2.2項(xiàng)下內(nèi)容分組處理，采用Western blot檢測(cè)KLF4的蛋白表達(dá)。

2.8 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)KLF4的表達(dá)采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析KLF4的表達(dá)。按2.3項(xiàng)下第二部分實(shí)驗(yàn)方法分組處理細(xì)胞至觀察終點(diǎn)，細(xì)胞經(jīng)PBS 洗滌，以4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，加入Triton-X 100透化10 min，PBS洗滌，加入山羊血清封閉1 h。分別加入特異性熒光標(biāo)記的一抗(稀釋比例1 ∶50)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗(稀釋比例1 ∶1 000)，孵育1h，PBS洗滌，然后加入DAPI染核5 min，PBS洗滌后加入抗熒光淬滅劑，于倒置熒光顯微鏡下拍照，觀察KLF4的表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)EndMT表型標(biāo)志物表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果表明，Hcy誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)皮標(biāo)志物VE-cadherin的表達(dá)減少(P<0.05)，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)顯著增加(P<0.01)；SAL低、高劑量預(yù)孵育可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin的水平(P<0.05)，下調(diào)α-SMA的水平(P<0.05，P<0.01)，如Fig 1所示。結(jié)果表明，SAL預(yù)處理可抑制Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表型標(biāo)志物的變化。

Fig 1 Effects of SAL on expression of EndMT-related *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

3.2 SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力的影響劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，Hcy顯著誘導(dǎo)細(xì)胞遷移率增加為(150.69±21.97)%(P<0.01)；經(jīng)SAL低、高劑量預(yù)處理后，細(xì)胞的遷移率分別為(137.79±11.42)%和(105.58±10.44)%(P<0.01)，提示SAL預(yù)處理可降低Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力，如Fig 2所示。

3.3 SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞eNOS/NO信號(hào)軸的影響采用Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組eNOS的蛋白水平，硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO的含量。Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，NO的水平減少(P<0.05)。SAL預(yù)孵育可上調(diào)eNOS的表達(dá)，提高內(nèi)皮舒張因子NO的含量，如Fig 3和Tab 1所示。結(jié)果提示，SAL預(yù)給藥可上調(diào)eNOS/NO信號(hào)軸的水平，改善內(nèi)皮功能損傷。

Tab 1 Effect of SAL on Hcy-induced NO

Fig 2 Effect of SAL on migration of **P<0.01 vs control group;##P<0.01,ns vs model group

3.4 SAL對(duì)Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞KLF4表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明，SAL低、高劑量組預(yù)給藥可明顯降低Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的表達(dá)水平。細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果進(jìn)一步表明，與正常對(duì)照組比較，Hcy可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子KLF4由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，50 μmol·L-1的SAL預(yù)處理可降低KLF4的熒光強(qiáng)度，抑制KLF4的核轉(zhuǎn)位，如Fig 4所示。結(jié)果證實(shí)，SAL有效降低核轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)水平，并抑制KLF4的核轉(zhuǎn)位。

3.5 SAL和沉默KLF4對(duì)Hcy誘導(dǎo)的EndMT表型標(biāo)志物及KLF4/eNOS信號(hào)表達(dá)的影響為明確KLF4能否作為上游信號(hào)調(diào)節(jié)eNOS的水平，參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的EndMT，實(shí)驗(yàn)采用siRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的敲低表達(dá)。結(jié)果表明，與正常組比較，sicontrol組KLF4的表達(dá)沒有發(fā)生變化(P>0.05)；與sicontrol組相比，siKLF4轉(zhuǎn)染組顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)水平(P<0.01)，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)體系成功實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的沉默，見Fig 5A。Western blot 結(jié)果表明，Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞KLF4和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)增加(P<0.01)，eNOS及內(nèi)皮標(biāo)志物VE-cadherin的表達(dá)減少(P<0.01，P<0.05)；SAL組和siKLF4組均可上調(diào)Hcy誘導(dǎo)的HUVECs中eNOS和VE-Cadherin的表達(dá)，抑制KLF4和α-SMA的表達(dá)，見Fig 5B-C。與SAL+siKLF4的共處理組比較，SAL組及siKLF4組對(duì)表型標(biāo)志物的作用無(wú)明顯差異，結(jié)果提示，KLF4可能為SAL抑制Hcy誘導(dǎo)EndMT的重要信號(hào)，且KLF4可作為上游信號(hào)調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，紅景天苷可通過調(diào)節(jié)KLF4/eNOS信號(hào)途徑的表達(dá)水平，抑制Hcy誘導(dǎo)的EndMT。

Fig 3 Effect of SAL on eNOS expression in HUVECs induced by n=3)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of SAL on expression of KLF4 in HUVECs induced by n=3)**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs model group.

Fig 5 Effects of SAL and KLF4 silencing on expression of EndMT-related markers,KLF4 and eNOS induced by Hcy n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group;ns vs siKLF4 group or SAL group.

4 討論

EndMT是內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)、外損傷因素的作用下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的特殊狀態(tài)，其可通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的屏障及分泌功能惡化內(nèi)皮微環(huán)境，加劇內(nèi)皮功能障礙[12]。大量研究顯示，內(nèi)皮功能障礙伴隨eNOS/NO信號(hào)通路的表達(dá)變化，在高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙中起到關(guān)鍵作用[13-14]。NO為強(qiáng)效的內(nèi)皮舒張因子，主要由L-精氨酸在一氧化氮合酶eNOS的催化下生成，內(nèi)皮細(xì)胞生成釋放的NO經(jīng)擴(kuò)散至血管中層平滑肌細(xì)胞后，經(jīng)激活鳥苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)血管平滑肌的舒張效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)血管舒張功能，故eNOS/NO信號(hào)軸已成為血管藥理學(xué)研究的重要分子信號(hào)[15-16]。課題組前期研究表明，沉默內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的表達(dá)可抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移及表型差異，有效抑制EndMT，證實(shí)KLF4為EndMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。目前，雖然開展了大量eNOS/NO信號(hào)途徑的研究工作，但基于轉(zhuǎn)錄因子KLF4調(diào)節(jié)eNOS/NO信號(hào)軸的研究鮮見報(bào)道，因此本研究基于KLF4/eNOS信號(hào)途徑，開展EndMT介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能損傷的研究。

研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷為動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，積極尋找以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能為靶標(biāo)，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能障礙的創(chuàng)新藥物，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義。前期研究中，我們已證實(shí)紅景天苷可上調(diào)抗氧化信號(hào)Nrf2 的表達(dá)，改善Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，初步明確了其血管藥理學(xué)活性[11]。本研究以Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化為切入點(diǎn)，圍繞轉(zhuǎn)錄因子KLF4對(duì)eNOS/NO通路的影響，分析紅景天苷對(duì)EndMT的作用及分子機(jī)制，明確藥物的血管藥理學(xué)活性。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，Hcy誘導(dǎo)孵育48h明顯降低了內(nèi)皮特異性標(biāo)志物VE-cadherin的水平、上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞遷移力，表明Hcy顯著誘導(dǎo)EndMT。經(jīng)低、高劑量SAL預(yù)處理，可抑制細(xì)胞表型標(biāo)志物的變化，降低細(xì)胞遷移能力，證實(shí)SAL有效抑制EndMT，且作用與上調(diào)eNOS/NO信號(hào)通路的水平，下調(diào)KLF4的蛋白表達(dá)有一定關(guān)系。采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察KLF4在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)定位，揭示SAL可抑制KLF4由細(xì)胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，由此表明SAL干預(yù)EndMT的作用機(jī)制與抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF4的活性相關(guān)。為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子KLF4對(duì)eNOS/NO信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，系統(tǒng)分析SAL抑制EndMT的分子機(jī)制，我們采用siRNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞KLF4的沉默。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默KLF4可上調(diào)細(xì)胞eNOS/NO信號(hào)的水平，提示KLF4可能為調(diào)節(jié)eNOS的上游分子信號(hào)參與調(diào)節(jié)血管舒張功能。經(jīng)組間比較，SAL組、siKLF4組及SAL+siKLF4共給藥組對(duì)細(xì)胞表型標(biāo)志物VE-cadherin及α-SMA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，表明KLF4可為SAL抑制EndMT的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。因此，本研究首次報(bào)道了紅景天苷通過調(diào)節(jié)KLF4/eNOS信號(hào)途徑，抑制Hcy誘導(dǎo)EndMT的作用，但其確切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待深入研究。