基于生物信息學(xué)方法分析心肌梗死大鼠miRNA芯片

姚道敏,謝 亮,宮劍濱,朱 靜,劉 晶

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院心臟內(nèi)科，江蘇 南京 210000)

心肌梗死是導(dǎo)致心臟重塑和慢性心衰發(fā)生的常見(jiàn)不良心血管事件，發(fā)病率和致死率居高不下，患者病理性心肌改變的分子機(jī)制仍未得到充分闡釋[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為非編碼RNA的一種，長(zhǎng)度在20個(gè)核苷酸左右，廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織細(xì)胞內(nèi)，在基因的表達(dá)調(diào)控中具有重要的作用[2]。miRNA通常與信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3′非翻譯區(qū)( 3′untranslated region，3′UTRs)或編碼序列(coding sequence,CDS)區(qū)結(jié)合抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解。miRNA與靶基因的5′非翻譯區(qū)(5′untranslated regions，5′UTRs)結(jié)合能激活轉(zhuǎn)錄[3]。有關(guān)MicroRNA在心肌梗死發(fā)生發(fā)展中的研究日益增多。MiR-15、miR-195、miR-122 、miR-181a等miRNA在心肌梗死后表達(dá)增加，而MiR-24、miR-138、miR-214、miR-499等miRNA在心肌梗死后表達(dá)減少。實(shí)驗(yàn)表明根據(jù)這一變化規(guī)律，相應(yīng)得使miRNA過(guò)表達(dá)或抑制能有效改善心肌梗死的癥狀。特殊的是，MiR-320在心肌梗死后表達(dá)減少，過(guò)表達(dá)MiR-320不能減輕心肌梗死的癥狀反而促進(jìn)心肌凋亡和壞死的發(fā)生。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是MiR-320抑制的靶基因?qū)π呐K具有保護(hù)作用[2]。MiRNA在心肌梗死中的作用復(fù)雜，本研究以microarray芯片結(jié)果為切入點(diǎn)，尋找心肌梗死中新的LncRNA-miRNA-mRNA三元關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 大鼠心肌梗死模型的制備8-10周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠(275±25) g,6只，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(軍)2012-0014。隨機(jī)分為2組(n=6):心肌梗死(MI)組和假手術(shù)(sham)組。以50 mg·kg-1的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉(產(chǎn)品批號(hào)：11751，Sigma Aldrich，USA)麻醉大鼠并將其固定在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上。心電圖機(jī)(CardiMax FX-7202，錫爾摩電氣有限公司，中國(guó))電極連接在四肢皮下，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管插管并連接呼吸機(jī)(HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)，成都市泰盟軟件有限公司，中國(guó))，控制潮氣量在3 mL·kg-1，呼吸比2 ∶1，呼吸頻率60-70次/min。縱行切開(kāi)心臟最強(qiáng)波動(dòng)處的皮膚約4 cm，鈍性分離，于第3或4肋間開(kāi)胸，將心臟暴露。用6-0線在左心耳根部下方3-5 mm處連同少量心肌組織縫扎左冠狀動(dòng)脈前降支。當(dāng)缺血區(qū)心肌變蒼白，運(yùn)動(dòng)減弱，心電圖I、avL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高0.1 mV持續(xù)30 min表明結(jié)扎成功。逐層關(guān)胸，置于37 ℃恒溫下使大鼠蘇醒。假手術(shù)組進(jìn)行相同的操作，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。術(shù)后4 h再次麻醉大鼠，快速開(kāi)胸取心臟，用眼科剪(南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院普外科)小心沿左室剪下梗死心肌組織，立即置于液氮中冷凍，然后置于干冰中送樣。

1.2 miRNA芯片由上海康成生物技術(shù)有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和miRNA芯片雜交。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用TRIzol試劑(Invitrogen)提取缺血心肌細(xì)胞中的RNA，純化后用nanodropND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)，賽默)，測(cè)量RNA濃度，并通過(guò)凝膠電泳確定RNA完整性。接下來(lái)使用miRCURYTMHy3TM/Hy5TM功率標(biāo)記試劑盒標(biāo)記樣品，并在miRCURYTMLNA陣列(v.18.0)上雜交。在洗滌步驟之后，使用Agilent Microarray Scanner 和Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行miRNA陣列掃描，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 lncRNA芯片由上海康成生物技術(shù)有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)芯片雜交。簡(jiǎn)言之，在去除核糖體RNA(Ribosomal RNA，rRNA)后，從總RNA中純化mRNA(mRNA-ONLYTM真核mRNA分離試劑盒，Epicentre)。然后，使用Quick Amp Labeling Kit將每個(gè)樣品擴(kuò)增并沿著轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄為熒光cRNA。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)純化標(biāo)記的互補(bǔ)RNA(complementary RNA，cRNA)。標(biāo)記的cRNA的濃度和比活性通過(guò)NanoDrop ND-1000測(cè)量。加入5 μL 10×封閉劑和1 μL 25×Fragmentation Buffer裂解1 μg每個(gè)標(biāo)記的cRNA，然后將混合物在60 ℃加熱30 min，最后加入25 μL 2×GE雜交緩沖液稀釋標(biāo)記的cRNA。將50 μL的雜交溶液分配到墊片載玻片中，并組裝到LncRNA表達(dá)微陣列載玻片上。將載玻片在安捷倫雜交爐中于65 ℃孵育17 h。洗滌固定雜交陣列，使用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)進(jìn)行掃描，用Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 mRNA芯片由上海康成生物技術(shù)有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和mRNA芯片雜交。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol(Invitrogen)和RNeasy試劑盒(Qiagen)，從大鼠心肌組織中提取總RNA，包括DNase消化步驟，并完成RNA質(zhì)量評(píng)估。使用安Quick Amp Labeling Kit對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。然后將標(biāo)記的探針與全大鼠基因組寡核苷酸微陣列試劑盒(包括41 000個(gè)大鼠基因和轉(zhuǎn)錄本；安捷倫)在65 ℃雜交緩沖液中雜交。過(guò)17 h，在室溫下，先用0.5×SSC/0.01% SDS洗滌5 min，再用0.06×SSC洗滌2 min。用安捷倫DNA微陣列掃描儀掃描標(biāo)記物強(qiáng)度，用Agilent Feature Extraction Software(版本10.5.1.1)提取數(shù)據(jù)結(jié)果，用安捷倫GeneSpring GX軟件(版本10.0)進(jìn)行進(jìn)一步分析。使用Agilent FE單色方案在GeneSpring GX中對(duì)微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理。中對(duì)微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理。

1.5 差異表達(dá)的miRNA分析使用MEV軟件(v4.9)進(jìn)行差異表達(dá)的miRNA的系統(tǒng)聚類(lèi)，以顯示可區(qū)分的基因。根據(jù)基因之間的距離將基因分組在一起。系統(tǒng)聚類(lèi)的默認(rèn)距離度量是皮爾遜相關(guān)性，選擇的鏈接方法是平均鏈接聚類(lèi)。采用在線網(wǎng)絡(luò)工具Ehbio(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制差異表達(dá)的miRNA的火山圖。

1.6 lncRNA-miRNA相互作用預(yù)測(cè)對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)的lncRNA和mRNA進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，并計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)(PCC)。LncTar是一款通過(guò)自由能(ndG)最小化預(yù)測(cè)lncRNA-RNA相互作用的在線網(wǎng)絡(luò)工具(http://www.cuilab.cn/lnctar)。ndG被認(rèn)為是確定配對(duì)的RNA是否相互作用的臨界值，一般設(shè)為-0.1。可以用于預(yù)測(cè)各種類(lèi)型的RNA分子(mRNA，lncRNA，miRNA)和其他類(lèi)型的非編碼RNA之間的相互作用。

1.7 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析miRNA靶基因預(yù)測(cè)使用miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)進(jìn)行，該軟件集成了mirTarBaseV7.0，TargetScanV7.1和miRDBV5.0的預(yù)測(cè)結(jié)果。Bindingp≥0.95被認(rèn)為是作為miRWalk中預(yù)測(cè)分析的臨界標(biāo)準(zhǔn)。將預(yù)測(cè)的上調(diào)的miRNA靶基因與mRNA芯片中下調(diào)的mRNA取交集，同時(shí)將預(yù)測(cè)的下調(diào)的miRNA的靶基因與mRNA芯片中上調(diào)的mRNA取交集，用KOBAS在線工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對(duì)這兩組交集基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway分析。GO分析的結(jié)果顯示了基因的細(xì)胞定位，生物學(xué)過(guò)程和分子功能。KEGG分析結(jié)果用于確定基因參與的重要途徑。P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)用作定義目標(biāo)基因及其相關(guān)功能和途徑之間存在明顯相關(guān)性的閾值。

1.8 lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建綜合lncRNA-miRNA相互作用和miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析結(jié)果，采用Cytoscape軟件(3.72版)進(jìn)行l(wèi)ncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)整合。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用2-ΔCt方法將lncRNA，mRNA，miRNA的相對(duì)表達(dá)水平表示為倍數(shù)變化。Fisher的精確檢驗(yàn)用于GO分析和pathway分析。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片結(jié)果分析按Foldchange≥1.5，P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，508個(gè)miRNAs結(jié)果中，與對(duì)照組相比，大鼠心肌梗死組織miRNA芯片結(jié)果中，13個(gè)miRNAs明顯上調(diào)(miR-132-3p、miR-146b-5p、miR-18a-5p、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-222-5p、miR-223-3p、miR-328b-3p、miR-365-5p、miR-449a-5p、miR-490-5p、miR-6333、miR-877)，6個(gè)miRNAs明顯下調(diào)(miR-122-3p、miR-146a-3p、miR-181b-1-3p、miR-30c-1-3p、miR-3591、miR-3596c)。如Fig 1A所示，明顯上調(diào)表達(dá)的13個(gè)miRNAs位于火山圖中右側(cè)，而明顯下調(diào)表達(dá)的6個(gè)miRNAs則位于左側(cè)。系統(tǒng)聚類(lèi)圖(Fig 1B)中可見(jiàn)差異表達(dá)的miRNAs的變化情況。

Fig 1 Volcano plot ( A) and hierarchical clustering ( B) of differentially expressed miRNAs

2.2 lncRNA芯片結(jié)果分析按照Foldchange≥2，P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，在心肌梗死組織和正常組織之間有75個(gè)lncRNAs明顯差異表達(dá)，其中30個(gè)lncRNAs上調(diào)和45個(gè)lncRNAs下調(diào)。數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)存在的lncRNAs有14個(gè)，其中10個(gè)lncRNAs (NR_133672、ENSRNOT00000057772、ENSRNOT00000050986、ENSRNOT00000058957、ENSRNOT00000002846、ENSRNOT00000027501、ENSRNOT00000071997、ENSRNOT00000075631、NR_126574)下調(diào)，4個(gè)lncRNAs(ENSRNOT00000076118、NR_132625、ENSRNOT00000076620、ENSRNOT000000 48374)上調(diào)。

2.3 mRNA芯片結(jié)果分析按照Fold change≥2，P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，心肌梗死組與對(duì)照組相比，差異表達(dá)的mRNAs共有331個(gè)，其中189個(gè)mRNAs明顯上調(diào)，142個(gè)mRNAs明顯下調(diào)。

2.4 lncRNA-miRNA相互作用結(jié)果分析采用LncTar對(duì)19個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(Tab 1)和篩選的14個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)存在的差異表達(dá)的lncRNAs(Tab 2)進(jìn)行相互作用預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們之間都有相互結(jié)合的作用位點(diǎn)，這一結(jié)果印證了miRNA在體內(nèi)具有廣泛的作用靶點(diǎn)。對(duì)差異表達(dá)的lncRNA和差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算，Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值≥0.95的lncRNA和miRNA之間可能存在著正向或負(fù)向調(diào)控的作用。為進(jìn)一步尋找潛在的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這里僅匯總Pearson相關(guān)系數(shù)≤-0.95的lncRNA-miRNA的結(jié)果，見(jiàn)Tab 3。

Tab 1 Differentially expressed miRNAs

Tab 2 Differentially expressed lncRNAs

Tab 3 Analysis of interaction between LncRNAs and mRNAs

2.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析按照P≤0.05，F(xiàn)oldchange≥1.5的標(biāo)準(zhǔn)篩選mRNA芯片中的差異mRNA(附Tab 1),與差異表達(dá)的miRNA預(yù)測(cè)的靶基因取交集的結(jié)果如韋恩圖(Fig 2)所示，交集基因見(jiàn)Tab 4。GO和KEGG Pathway分析結(jié)果(Fig 3)表明miRNA的靶基因主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，富集在Hippo 信號(hào)通路，HIF-1信號(hào)通路，F(xiàn)oxO信號(hào)通路，小分子代謝過(guò)程，輔酶生物合成過(guò)程，輔因子的生物合成，脫甲基酶活性等條目中。從眾多GO和KEGG pathway條目中挑選出的凋亡相關(guān)基因有Rnf7、I118、Sort1、Igf1、Tgfb2、Serpine1、Tyrobp、Lrp1、Sqstm1、Sema5a、Atp7a、Deptor、Ace、Tsc22d1、Stat3；自噬相關(guān)基因有Stat3、Deptor、Sqstm1；線粒體相關(guān)基因有Coq5、Qrsl1、Rnf7、Acsl1、Igf1、Stat3、Acsl4、Sqstm1、Ywhaz、Tmem65、Atp7a。這些基因與miRNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系如Tab 5所示。

Tab 4 Genes in intersection of Venn diagram

Tab 5 Correspondence between apoptotic,autophagy, mitochondrial related genes and miRNAs

Fig 2 Intersection of down-regulated mRNAs with predicted target genes of up-regulated miRNAs(A) and intersection of up-regulated mRNAs and down-regulated miRNAs predicted target genes(B)

2.6 lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果綜合miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，miRNA與lncRNA相互作用結(jié)果，以及凋亡，自噬或線粒體相關(guān)基因，找出多條lncRNA-miRNA-mRNA三元關(guān)系。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如Fig 4所示。LncRNA ENSRNOT00000076620的下調(diào)可能引起miR-146b-5p的上調(diào)，從而抑制Stat3，Sh3pxd2b、Tmem167a、Nop16、Sele、Rnf7、Qrsl1相關(guān)基因的表達(dá)。lncRNAENSRNOT00000057772的上調(diào)可能引起miR-181b-1-3p的下調(diào)，從而使對(duì)Tnpo1、Sdc4、Pcsk5基因的抑制作用減弱。LncRNA ENSRNOT00000071991的上調(diào)可能引起miR-122-3p的下調(diào)，從而使對(duì)Cdkn1a、Rfx3、RGD1559622、Atp7a、Ckap4、Deptor、Cdc42ep4、St3gal1基因的抑制作用減弱。LncRNA ENSRNOT00000075631的上調(diào)可能引起miR-146a-3p、miR-3591的下調(diào)，從而使對(duì)Rfx3、St3gal1、Slc6a6、Sdc4、Mboat1、Rcn1、Agfg1、Sh3pxd2b、Ace、Adamts1、Add2、Adamts12、Ddx21、Nolc1、Uchl1、Ankar、Mboat1基因的抑制作用減弱。

Fig 3 KEGG analysis of intersection genes of down-regulated mRNAs and predicted target genes of up-regulated miRNAs(A); KEGG analysis of intersection genes of up-regulated mRNAs and predicted target genes of down-regulated miRNAs(B); GO analysis of intersection genes of down-regulated mRNAs and predicted target genes of up-regulated miRNAs(C); GO analysis of intersection genes of up-regulated mRNAs and predicted target genes of down-regulated miRNAs(D)

Fig 4 LncRNA-miRNA-mRNA ternary relationshipRed ovals represent down-regulated miRNAs,Yellow oval represents up-regulated miRNAs.Blue triangles represent target genes.Purple triangles represent apoptotic and autophagy as well as mitochondrial-related genes.Green arrows represent up-regulated lncRNAs.Orange arrows represent down-regulated lncRNAs.

3 討論

心肌梗死是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、新生血管形成及纖維化等表型發(fā)揮功能[2]。LncRNA-Xist 5'發(fā)揮海綿作用，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-29b-1-5p對(duì)靶標(biāo)Bcl2l2的作用，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡[4]。LncRNA- APF靶向miR-188-3p，后者導(dǎo)致ATG7上調(diào)，從而促進(jìn)心肌缺血/再灌注損傷中的心肌細(xì)胞自噬[5]。

本研究成功制備了心肌梗死模型，共獲得19個(gè)明顯差異表達(dá)的miRNAs。其中一些已通過(guò)大鼠心梗模型實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。它們是miR-21、miR-132、miR-222、miR-223-3p、miR-146a/b、miR-181b、miR-449a-5p、miR-122。臨床試驗(yàn)表明miR-328、miR-18a是治療心肌梗死的潛在候選分子。目前沒(méi)有相關(guān)報(bào)道表明miR-365-5p、miR-490-5p、miR-6333、miR-30c-1-3p、miR-3591、miR-3596c、miR-877與心肌梗死相關(guān)。有文獻(xiàn)表明miR-3596c、miR-877經(jīng)qPCR驗(yàn)證在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中差異表達(dá)[6]。它們可能成為新的心肌梗死分子標(biāo)志物，且其功能有待進(jìn)一步研究。

MiR-132能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重塑，減少大鼠心肌梗死面積。miR-132上調(diào)，導(dǎo)致白細(xì)胞介素1β下調(diào)，Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平降低，左心室射血分?jǐn)?shù)、最大心率增加，左心室壓力降低[7]。LncRNA-Ang362與鄰近基因(miR-221和miR-222)共同發(fā)揮調(diào)控功能。這兩個(gè)miRNA在響應(yīng)血管緊張素II時(shí)過(guò)表達(dá)，并與LncRNA-Ang362共轉(zhuǎn)錄以調(diào)節(jié)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖[8]。miR-146b與miR-146a在3′末端有兩個(gè)不同的核苷酸，具有相似的生物學(xué)功能。miR-146a/b通過(guò)直接結(jié)合IRAK-1、TRAF6和MyD88，抑制核因子κB途徑的激活，減少缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。另外，miR-146a/b還靶向內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，這可能會(huì)增加缺氧引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷。核糖核酸酶L是miR-146b的直接靶標(biāo)，抑制miR-146b可促進(jìn)激活核因子κB和具有心臟保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子Stat3，miR-146b過(guò)表達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。過(guò)表達(dá)的miR-223直接結(jié)合RASA1,促進(jìn)MEK1/2、ERK1/2和AKT的磷酸化，防止大鼠心肌梗死后心臟功能惡化和心肌纖維化[10]。同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-223能沉默PARP-1，激活A(yù)kt/mTOR途徑，減輕大鼠心肌細(xì)胞因缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和過(guò)度自噬[11]。PDCD4是一種促凋亡蛋白，miR-21靶向PDCD4基因調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)心肌miR-21基因能夠改善心臟功能[12]。miR-181b-5P通過(guò)與AKT3和PIK3R3的3'UTRs直接結(jié)合，調(diào)節(jié)大鼠缺血心肌的細(xì)胞凋亡和組織損傷的發(fā)生發(fā)展[13]。lncRNA-MIAT作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA通過(guò)使miR-181b海綿化而增加STAT3的表達(dá)促進(jìn)增殖并阻止凋亡[14]。lncRNA-XIST通過(guò)結(jié)合靶向Notch1基因的miR-449調(diào)控大鼠心肌細(xì)胞凋亡[15]。miR-122-5p的下調(diào)可以造成Bax、caspase-3和Bcl-2表達(dá)水平的上調(diào)，誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞抗凋亡。目前miR-122-3p的作用還不清楚[16]。臨床研究表明miR-328和miR-18a在心肌梗死發(fā)生時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[17-18]。

為進(jìn)一步研究 miRNAs 的上下游作用靶點(diǎn)以及它們?cè)谛募∪毖毖鯛顟B(tài)下的作用機(jī)制，我們結(jié)合篩選出的差異lncRNA和miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析結(jié)果，找到了一些可能存在的lncRNA-miRNA-mRNA三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在心肌梗死發(fā)生時(shí)，有可能存在如下作用機(jī)制:(1) LncRNA ENSRNOT00000076620/NR_132625的下調(diào)導(dǎo)致miR-146b-5p的上調(diào)，上調(diào)的miR-146b-5p通過(guò)下調(diào)STAT3，Rnf7激活心肌細(xì)胞凋亡，或通過(guò)下調(diào)Qrsl1引起心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，加劇心肌梗死相關(guān)癥狀。(2) LncRNA ENSRNOT00000071991的上調(diào)引起miR-122-3p、miR-122-5P及其前體miR-122的下調(diào)，下調(diào)的miR-122通過(guò)上調(diào)Deptor(mTOR抑制劑)，抑制大鼠心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，加劇心肌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。(3) LncRNA NR_132625的下調(diào)導(dǎo)致miR-21-3P，miR-18a-5p的上調(diào)，線粒體相關(guān)基因Coq5、Acsl1、Tmem65表達(dá)因此降低，心肌細(xì)胞線粒體受損，心肌梗死癥狀加重。