W3D通過調控TLR4/MD2-NF-κB p65信號通路改善LPS誘導的小鼠急性肺損傷

史新陽，高曉慧，趙 蓓，唐 莉，李青山,2

(1.山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001；2.基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室，山西中醫藥大學，山西 太原 030024)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由創傷、感染等多種因素引起的疾病，臨床表現主要有胸悶、氣短、氣促、咯血等，發展至嚴重階段可導致急性呼吸窘迫綜合征，病死率達30%-45%[1]。ALI的主要發病機制與過度失控的炎癥反應，繼而引起炎性細胞浸潤及多種炎癥因子過度表達密切相關[2]。作為革蘭氏陰性細菌細胞壁主要成分的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，能夠誘導TLR4/MD2-NF-κB信號通路活化，啟動細胞內炎性信號的傳導[3]而誘發炎癥，其中TLR4/MD2復合體可特異性識別促炎信號LPS，激活NF-κB的入核，啟動相關基因轉錄，合成促炎因子，誘發ALI。目前，ALI的治療仍以舒血管藥、抗氧化劑、糖皮質激素、抗炎藥為主[4]，其中抗炎藥的應用在ALI治療中占據重要地位，然而僅僅依靠使用一種或幾種抗炎藥物治療尚難以有效遏制ALI的發生和發展[5]。因此，研發新型高效ALI治療藥物仍是目前亟待解決的重大課題。

苯并噁唑類化合物由于其所具有的多種生物學活性而成為新藥設計合成中重要的醫藥中間體，其中以氯唑沙宗(5-氯-2-苯并噁唑酮)為代表的苯并噁唑酮類化合物則呈現出良好的鎮痛作用，且大量文獻已證明取代位置的差異會影響其生物活性，例如N-取代后，化合物往往呈現出抗結核分枝桿菌[6]、抗焦慮[7]、選擇性激動毒蕈堿型m1受體[8]等活性，6位取代后化合物具有一定的細胞毒性，呈現出抗腫瘤潛力[9]。課題組以4位為衍生位點，設計合成了系列4-取代苯并噁唑酮衍生物[10-11]，發現化合物4-(5’-二甲氨基)-萘磺酰氧基苯并噁唑酮(4-(5′-dimethylamino)-naphthalenesulfonyl-2(3H)-benzoxazolone，W3D)具有高效體外抗炎活性，其對LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞NO的IC50值為17.67 μmol·L-1，對IL-6的IC50值為8.608 μmol·L-1，對IL-1β的IC50值為20.07 μmol·L-1，與臨床用藥塞來昔布活性(NO- IC50為17.89 μmol·L-1，IL-6- IC50為36.04 μmol·L-1，IL-1β- IC50為17.94 μmol·L-1)相當[12]。然而，化合物W3D能否改善LPS誘導的ALI，作用機制如何未知。本研究通過建立LPS誘導的ALI模型，測定小鼠肺部病理組織改變，血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達以及肺組織中TLR4、MD2、p-IRAK4、p65的表達來評價化合物W3D的抗ALI活性及其作用機制。

1 材料

1.1 試劑W3D(批號：20200520，山西醫科大學藥學院藥物化學教研室提供，純度≥98%)；LPS(北京索萊寶科技有限公司)；氯唑沙宗(批號：C10403818，麥克林試劑，純度98%)；TLR4抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；MD2抗體(Abcame公司)；MPO試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)；HRP二抗、RIPA裂解液等其他試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物健康ICR小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，清潔級，購自山西醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(晉)2019-0004。飼養條件：25℃±2℃，自由進食飲水。

1.3 儀器全波長多功能酶標儀(美國Thermo公司)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；TGL-16gP高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；漩渦混懸器(北京大龍儀器)；702型超低溫冰箱(美國Thermo公司)；400S型超聲波清洗機(深圳超潔科技實業有限公司)；超純水儀(力康集團)；水浴鍋(國華電器)。

2 方法

2.1 動物處理取48只ICR小鼠，隨機分為對照組，模型組，氯唑沙宗組(12.5 mg·kg-1)，W3D組(3.125、6.25、12.5 mg·kg-1)，每組8只。4%水合氯醛麻醉小鼠后，除對照組氣道滴入生理鹽水外，其余各組按2.5 mg·kg-1劑量[13]，于氣道滴入LPS，4 h后給藥，12 h后麻醉小鼠，放血處死取出肺臟。

2.2 小鼠肺濕干比計算取小鼠右肺組織，濾紙吸干表面水分稱取濕重(wet wt，wwt)，置50 ℃烘箱48 h至恒重，稱取干重(dry wt，dw)，計算肺濕干比(wet/dry ratio，wwt/dw)。

2.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化生理鹽水洗凈肺臟，去除血漬，并置于濾紙上吸干表面水分，剪下左上肺后固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4 試劑盒法檢測MPO活性取小鼠肺臟與生理鹽水按體積比1 ∶9勻漿，并按照說明書操作，在450 nm處測定吸光度值，計算MPO活性。

2.5 ELISA法測定小鼠血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β含量小鼠麻醉后，放血處死，血液室溫放置1 h后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清即得血清。按說明書操作測定小鼠血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 Western blot法檢測TLR4、MD2、p-IRAK4、p65的蛋白表達取肺組織100 mg，RIPA提取總蛋白并定量，經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗后成像，ImageJ軟件分析灰度。

3 結果

3.1 化合物W3D對小鼠肺組織形態與肺濕干比的影響LPS造模后，與對照組相比，模型組小鼠肺組織明顯水腫，并出現嚴重充血現象，W3D作用后肺組織水腫及充血現象較模型組明顯減輕。肺組織濕干比結果如Fig 1所示，模型組較對照組相比濕干比顯著提高，給藥組濕干比明顯降低，且呈一定的劑量依賴性，當給藥劑量為6.25 mg·kg-1時即具有顯著性差異。

Fig 1 Effects of compound W3D on lung wwt/dw ##P<0.01 vs control,*P<0.05 vs LPS group

3.2 化合物W3D對小鼠肺組織病理學的影響如Fig 2所示，對照組肺組織未見病理改變；模型組則出現局部肺泡腔結構不清，大量粒細胞浸潤(紅色箭頭)，局部出血(橙色箭頭)，血管損傷，平滑肌細胞胞核固縮深染等明顯病理改變；氯唑沙宗組肺泡壁可見粒細胞浸潤(紅色箭頭)，肺組織局部肺泡壁增厚，部分平滑肌細胞胞核固縮深染，局部可見出血；W3D作用后，低劑量(3.125 mg·kg-1)組肺組織大面積肺泡壁增厚，肺泡腔結構不清，肺泡壁及肺泡腔內可見大量粒細胞浸潤(黑色箭頭)，局部支氣管周圍輕度出血(黃色箭頭)，大量支氣管上皮細胞腫脹，胞質呈空泡狀，較模型組未見明顯改善；中劑量(6.25 mg·kg-1)組肺泡腔大小不一，肺泡壁上可見大量粒細胞浸潤(紅色箭頭)，支氣管損傷，少量上皮細胞壞死，胞核固縮，胞質呈空泡狀(黃色箭頭)，肺組織局部肺泡壁增厚，較模型組有輕度改善；高劑量(12.5 mg·kg-1)組，肺組織支氣管、肺泡壁等結構逐漸恢復清晰，較少粒細胞浸潤(黃色箭頭)，無血管損傷及出血等現象，較模型組病理學切片有明顯改善。

Fig 2 Effects of compound W3D on histopathological changes in LPS-induced lung tissues (×400)

3.3 化合物W3D對小鼠肺組織MPO活性的影響與對照組相比，LPS造模后MPO酶活性顯著提高(Fig 3)，W3D作用后MPO酶活性呈劑量依賴性降低，且當給藥劑量為12.5 mg·kg-1時，較模型組具有顯著性差異(P<0.01)，且與氯唑沙宗組活性相當。

Fig 3 Effects of compound W3D on lung MPO n=3)##P<0.01 vs control,**P<0.01 vs LPS group

3.4 化合物W3D對小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量的影響模型組TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS含量明顯升高(Fig 4)，化合物W3D作用后TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS呈劑量依賴性降低，尤其對TNF-α，IL-6和IL-1β的抑制活性明顯優于氯唑沙宗組，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 4 Effect of compound W3D on TNF-α, IL-6,IL-1β,iNOS in mouse n=6)##P<0.01 vs control,*P<0.05 ,**P<0.01 vs LPS group

3.5 化合物W3D對TLR4、MD2、p-IRAK4、p65蛋白表達的影響模型組小鼠肺組織TLR4、MD2、p-IRAK4、p65蛋白水平與對照組相比明顯增高；W3D作用后，TLR4、MD2和p65的蛋白表達明顯降低，且IRAK4的磷酸化水平明顯減弱，并呈現劑量依賴性(Fig 5)。

Fig 5 Effects of W3D on expression levels of relative proteins in LPS-induced ALIA:The Western blot results of protein TLR4,MD2,p-IRAK4,and p65;B:The relative quantity of TLR4,MD2,p-IRAK4,and p65 to that of β-actin (compared with the control group) n=3)##P<0.01 vs control,**P<0.01 vs LPS group

4 討論

氯唑沙宗是一種經典的用于軟組織損傷、筋膜炎等疾病的解熱鎮痛藥物[14]，其活性與有效抑制iNOS的表達密切相關。化合物W3D是以氯唑沙宗為骨架，經結構修飾后獲得的新型苯并噁唑酮衍生物，且已證明其體外抗炎鎮痛活性優于氯唑沙宗[15-16]，但該類骨架結構化合物對于肺炎的治療是否有效未見文獻報道。因此，我們建立了LPS誘導的小鼠ALI模型，通過測定小鼠肺部病理組織改變以及血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達來評價化合物對ALI的治療作用。結果顯示氯唑沙宗與化合物W3D均可抑制血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，改善ALI。同時實驗結果也進一步驗證了氯唑沙宗與iNOS的作用，較炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β，氯唑沙宗對iNOS的抑制作用更加明顯，化合物W3D與氯唑沙宗相比，在具有同樣高效iNOS抑制作用的同時，對炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表現出了更為明顯的抑制活性，尤其是對炎癥因子IL-6的抑制活性(78.85%)與同等劑量的塞來昔布(34.06%)相比，表現出一定的治療優勢。

與此同時，我們發現該類結構化合物對MPO表現出顯著的抑制作用，而MPO的表達與巨噬細胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，引起中性粒細胞的趨化和活化有關[17]。課題組前期已證實，化合物W3D可顯著抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7炎癥因子的釋放，且其作用與調控TLR4-NF-κB信號通路相關[12]。本研究中再次測定了TLR4、MD2、p-IRAK4蛋白的表達，且結果顯示化合物W3D可顯著抑制肺組織中TLR4、MD2蛋白的表達，抑制IRAK4的磷酸化。作為NF-κB通路中重要的轉錄子，p65蛋白可與基因啟動子或增強子特異性結合而啟動轉錄，也是NF-κB信號通路激活的關鍵蛋白[18]。本研究也進一步證實了化合物W3D可劑量依賴性抑制p65蛋白的表達，結果與體外實驗結果一致。我們的實驗結果不僅證明了該類化合物可通過抑制iNOS發揮抗炎作用，也揭示了其對TLR4-NF-κB信號通路的調控是發揮活性的又一重要作用機制，為該類結構化合物的進一步結構優化提供一定的理論基礎。

綜上，本實驗結果表明，化合物W3D可通過調控TLR4/MD2-NF-κB p65信號通路改善LPS誘導的小鼠急性肺損傷，而苯并噁唑酮結構具有成為ALI治療藥物研究重要骨架的潛力，為進一步抗ALI藥物的研發提供了重要依據。