槲皮素通過靶向GAS5/Notch1信號通路促進乳腺癌細胞凋亡的研究

蔣多晨，金 樂，陳洪曉，張 蕾，陳昭琳，居 靖

(1.安徽醫科大學附屬安慶醫院，安徽 安慶 246003；2.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

作為僅次于肺癌的最常被診斷出的癌癥，乳腺癌也是全球范圍內女性癌癥死亡的主要原因[1]。近幾年乳腺癌發病率在國內正在迅速增長且已位列首位，逐年加重[2]。手術治療、放療、化療、內分泌治療和靶向治療，這些都是目前臨床乳腺癌治療的有效手段。其中，化療在乳腺癌的治療過程中發揮著關鍵作用。除了一些傳統的化療藥物外，近年來對于中藥的抗癌研究逐漸受到研究者的重視。作為一種天然的小分子黃酮類化合物，槲皮素具有抗炎、抗氧化等多種藥理學作用,其抗癌作用日益受到關注，然而其抗腫瘤的分子機制尚未完全明確[3]。

近年來，大量非編碼RNA的發現不僅改變了研究者對癌癥病理生理的認識，也為癌癥治療開辟了新的前景。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA) 是一類轉錄本長度大于200個堿基的RNA，不編碼蛋白質，利用轉錄和轉錄后修飾等途徑在基因表達中起關鍵調控作用，進而參與多種生理和病理途徑的調節[4]。越來越多的證據表明，一些lncRNAs在多種癌癥(包括乳腺癌)細胞和組織中異常表達，可為惡性腫瘤分子診斷和治療提供靶點和依據[5]。作為一種腫瘤抑制因子，GAS5在乳腺癌細胞中低表達并有望成為乳腺癌潛在的治療靶點或預后預測因子。近年來發現，藥物通過調控GAS5起到抗腫瘤作用的研究嶄露頭角，這些研究為探究槲皮素的抗乳腺癌作用機制提供了新的思路[6-7]。

Notch1信號通路涉及多個細胞過程，例如增殖、分化、凋亡，細胞命運決定和干細胞維持。除此之外，它在腫瘤發生發展中的重要作用也不容忽視[8]。有研究顯示，GAS5可通過調控Notch1信號通路影響疾病進程，這些研究為我們深入探索乳腺癌中GAS5與Notch1信號通路的相關性提供了有力的參考依據[9-10]。

本研究旨在初步探討槲皮素是否通過影響GAS5來調控Notch1信號通路從而促進乳腺癌細胞凋亡，為乳腺癌分子診斷和靶向治療開拓更多可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7由中國科學技術大學朱濤教授課題組饋贈。

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(Quercetin,Q)，Sigma(貨號：Q4951-10G)；MTT試劑、DMSO試劑和姬姆薩原液，Solarbio(貨號：298-93-1、D8370、G1015)；血清、胰酶和RPMI 1640培養基，BI(貨號：04-001-1ACS、03-050-1ACS、01-100-1ACS)；Opti-MEM，Gibco(貨號：31985-070)；引物序列，上海生物工程公司；小干擾RNA，上海吉瑪基因公司；TRIzol Reagent和LipofectamineTM2000，Invitrogen(貨號：15596026、11668-019)；逆轉錄試劑盒和q RT-PCR試劑盒，TaKaRa(貨號：RR047A、RR820A)；Notch1、Jagged1、Hes1單克隆抗體，Cell Signaling Technology(貨號：3608、70109、11988)；Caspase3單克隆抗體，Bioss(貨號：bs-0081R)；Bcl-2、Bax單克隆抗體，BOSTER(貨號：BA0412、BA0315-2)；β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠二抗，中杉金橋(貨號：TA-09、ZB-2301、ZB-2305)；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒，BD(貨號：556547)；BCA試劑盒、一抗稀釋液和DEPC無酶水，碧云天(貨號：P0010S、P0023A 、R0021)。

1.1.3儀器 CO2培養箱(Heal Force)；流式細胞儀(Beckman Coulter)；ScanDrop2超微量核酸蛋白測定儀(Analytikjena)；Thermal Cycler PCR儀(天隆)；Applied Biosystems 7500實時熒光定量PCR儀(賽默飛)；化學發光成像儀(培清)，酶標儀(Molecular Devices)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 MCF-7細胞用RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清和1%雙抗)在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞處于對數生長期開始后續實驗。

1.2.2細胞轉染 6孔板接種對數生長期MCF-7細胞,待細胞密度達40%-60%，將3條GAS5小干擾RNA序列(siGAS5#1,siGAS5#2,siGAS5#3)及其陰性對照的小干擾RNA序列(sncRNA)，分別與LipofectamineTM2000混合孵育后加入各孔中(siRNA終濃度約為0.66 mg·L-1)。培養6 h后分別換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基和槲皮素藥液(80 μmol·L-1)繼續培養48 h。小干擾RNA序列如下所示：siGAS5#1：正義鏈5′-GGCUCUGGAU AGCACCUUATT-3′,反義鏈5′-UAAGGUGCUAUCC AGAGCCTT-3′;siGAS5#2：正義鏈5′-GCAAAGG ACUCAGAAUUCATT-3′,反義鏈5′-UGAAUUCUG AGUCCUUUGCTT-3′;siGAS5#3：正義鏈5′-GCAU GCAGCUUACUGCUUGTT-3′,反義鏈5′-CAAGCAG UAAGCUGCAUGCTT-3′;sncRNA ：正義鏈5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3MTT法檢測槲皮素對MCF-7細胞活力的影響 96孔板接種對數生長期MCF-7細胞，加入100 μL不同濃度的槲皮素(5、10、20、40、80、160 和320 μmol·L-1)，空白組和對照組加入等量培養基，作用24、48和72 h后，每孔加入100 μL MTT工作液，避光孵育4 h，吸去MTT，每孔加入150 μL DMSO，暗處慢搖，OD值用酶標儀在490 nm處測出。數據處理的公式為細胞活力/%=(藥物組OD值-空白組OD值/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4平板克隆形成實驗檢測槲皮素對MCF-7細胞增殖克隆能力的影響 6孔板接種對數生長期MCF-7細胞,加入不同濃度的槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)，處理24 h后加入完全培養基繼續培養。每3 d換液1次，并觀察細胞克隆增殖情況。待6孔板中已形成足夠菌落，無水乙醇固定，姬姆薩染液染色后，棄除染液，用自來水洗掉殘余染液，自然晾干后，在顯微鏡下觀察并用相機拍照。最后對每組的克隆細胞數量進行計算。

1.2.5Annexin V-FITC/PI法檢測槲皮素對MCF-7細胞凋亡的影響 6孔板接種對數生長期MCF-7細胞,加入不同濃度的槲皮素(40、80、160 μmol·L-1),處理48 h后收集細胞。加入冷PBS洗2次后用100 μL Binding buffer制細胞懸液，依次加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μL。室溫避光孵育15 min。加入400 μL Binding buffer混懸細胞后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR法檢測GAS5、Notch1信號通路以及凋亡相關蛋白的表達 在乳腺癌MCF-7細胞中，分別采用不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)、GAS5小干擾RNA(siGAS5#1，siGAS5#2，siGAS5#3)、槲皮素協同siGAS5#1處理24或48 h后，用TRIzol分別提取細胞總RNA，采用ScanDrop2超微量核酸蛋白測定儀將總RNA進行定量后，每組各取500 ng總RNA用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。PCR反應程序按以下條件進行:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環。采用相對定量法，以β-actin作為內參，將各Ct值代入公式2-△△Ct，比較各組的RNA相對表達量。所用引物序列如下所示:β-actin上游:5′-GCCAACACAGTGCT GTCTGG-3′，下游:5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCT TG-3′；GAS5上游:5′-CCTGTGAGGTATGGTGCTGG-3′，下游:5′-CTGTGTGCCAATGGCTTGAG-3′；Notch1上游:5′-GAATGGCGGGAAGTGTGAAGC-3′，下游:5′-TAGTCTGCCACGCCTCTGC-3′；Jagged1上游:5′-CCTGGGCTTTGAGTGTGAGTGTTC-3′,下游:5′-GTC GCAGTAGTAGCTGGCAATGAG-3′；Hes1上游:5′-AAGTGTGCTGGGGAAGTACC-3′，下游:5′- GGGG TAGGTCATGGCATTGAT-3′；Bcl-2上游:5′-GGGTC ATGTGTGTGGAGAG-3′,下游:5′-AGCCAGGAGA AATCAAACAG-3′；Bax上游:5′-GAACTGGACAAC AACATGGA-3′，下游:5′-GCAAAGTAGAAAAGGG CAAC-3′；Caspase3上游:5′-TGTCTTCTGTAATCGCC AAG-3′，下游:5′-CCGTTCGTTCCAAAAATTAC-3′。

1.2.7Western blot檢測Notch1信號通路以及凋亡相關蛋白的表達 在乳腺癌MCF-7細胞中，分別采用不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)、siGAS5#1、槲皮素協同siGAS5#1處理48 h后，提取細胞總蛋白，BCA 定量法定量后制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，恒壓轉膜，使蛋白由膠轉至PVDF膜，之后浸入封閉劑(5%脫脂牛奶)中室溫封閉2 h，TBST洗滌后，加一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗(1 ∶10 000)，常溫孵育2 h。膜經TBST 洗滌后ECL顯色，曝光成像。最后通過ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 槲皮素對MCF-7細胞活力的抑制作用MTT實驗結果表明，槲皮素作用24、48和72 h后均可抑制MCF-7細胞活力，并且作用時間越長抑制作用越強，呈時間依賴性。同時，與對照組相比，槲皮素濃度為40、80和160 μmol·L-1時，細胞活力明顯受到抑制，如Fig 1所示。隨著藥物濃度的增大，細胞活力逐漸降低，呈現濃度依賴性。因此我們將采用抑制效果較佳的40、80和160 μmol·L-1的槲皮素濃度組作用48 h后進行后續實驗。

2.2 槲皮素對MCF-7細胞增殖克隆能力的抑制作用如Fig 2所示，與對照組相比，隨著槲皮素濃度增大，細胞菌落變小，細胞克隆數量降低(P<0.01)，說明槲皮素可明顯抑制MCF-7細胞的增殖克隆能力且呈濃度依賴性。

2.3 槲皮素誘導MCF-7細胞凋亡流式細胞術結果表明，不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)處理48 h后，其各濃度組均能在一定程度上誘導MCF-7細胞凋亡。與對照組相比，槲皮素處理組(80、160 μmol·L-1)的細胞凋亡率普遍增高(Fig 3)。qRT-PCR和Western blot結果表明,槲皮素各濃度組均能不同程度地增加MCF-7細胞中凋亡相關蛋白Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表達水平，而降低Bcl-2的mRNA(Fig 4A)和蛋白(Fig 4B)表達水平。

2.4 槲皮素促進MCF-7細胞中GAS5的表達如Fig 5A所示，80、160 μmol·L-1槲皮素處理后，GAS5表達較對照組明顯升高，提示槲皮素可明顯促進MCF-7細胞中GAS5的表達。

Fig 1 Effect of quercetin on viability of MCF-7 cells at 24,48 and 72 A:24 h.B:48 h.C:72 h.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 2 Effect of quercetin on cell colonies of MCF-7 A:The colony-forming ability was measured by a colony-forming assay.B:Quantitative analysis showed the number of colonies of MCF-7 cells.**P<0.01 vs control group

2.5 槲皮素對MCF-7細胞中Notch1信號通路的影響與對照組相比，不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)處理MCF-7細胞后，Notch1信號通路中的相關蛋白Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA(Fig 4C)和蛋白(Fig 4D)表達水平均不同程度地下調，提示槲皮素可明顯抑制MCF-7細胞中Notch1信號通路的激活。

2.6 槲皮素通過靶向GAS5/Notch1信號通路促進MCF-7細胞凋亡如Fig 5B所示，與sncRNA組相比較，三條siGAS5序列中siGAS5#1具有更優的沉默效率，因此選擇用于后續實驗研究。在MCF-7細胞中，轉染siGAS5#1后，發現Notch1信號通路的相關蛋白Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA(Fig6C)和蛋白(Fig 6D)表達水平較其sncRNA組升高,而凋亡相關蛋白Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表達水平降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平升高(Fig 6A和Fig 6B)。更有趣的是，當用siGAS5#1與槲皮素(80 μmol·L-1)共處理48 h后，我們發現，與Q+sncRNA組相比，GAS5表達明顯下調(Fig5C)，而Notch1信號通路的相關蛋白Notch1、Jagged1、Hes1以及凋亡相關蛋白Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高,Bax和Caspase3的蛋白表達水平降低(Fig 7D和Fig 7B)，與其mRNA表達水平相似(Fig7C和Fig 7A)。這些結果提示槲皮素可通過靶向GAS5來調控MCF-7細胞中Notch1信號通路，從而誘導乳腺癌細胞的凋亡。

Fig 3 Effect of quercetin on apoptosis of MCF-7 A:MCF-7 cell apoptosis was detected by the Annexin V-FITC/PI double staining assay.B:Quantitative analysis showed the apoptotic rate of each group of MCF-7 cells.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 4 Effect of quercetin on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were examined by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein expressions were examined by Western blot.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 5 Effects of quercetin and siRNAs on GAS5 expression level in MCF-7 A:The expression of GAS5 in MCF-7 cells treated with quercetin was examined by qRT-PCR.B and C:MCF-7 cells were transfected with siRNAs and co-treated with quercetin(80 μmol·L-1).The GAS5 expression was examined by qRT-PCR.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs sncRNA group or Q+sncRNA group.

Fig 6 Effect of silencing GAS5 on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were detected by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein expressions were detected by Western blot.#P<0.05 vs sncRNA group.

Fig 7 Effects of GAS5 silence and co-treatment with quercetin(80 μmol·L-1) on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were examined by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase 3 protein expressions were examined by Western blot.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs Q+sncRNA group.

3 討論

乳腺癌一直以來因其惡性程度高、預后不良和復發率高等特點成為女性死亡率較高的癌癥[1]。近年來，中藥在腫瘤治療包括乳腺癌治療中因其療效優和副作用小等特點贏得人們越來越多的關注。然而其潛在的抗癌機制仍不明確，需要更多的研究者們繼續深入探究。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，可抗菌、抗炎、抗過敏、抗氧化以及降血壓，還能有效發揮防癌抑癌作用[3]。因此，對槲皮素抗癌分子機制的深入研究將為乳腺癌的防治提供理論依據。目前已有的研究指出槲皮素通過上調miR-146a抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[11]。本研究中的MTT、平板克隆形成實驗、流式細胞術以及Western blot結果均顯示槲皮素對乳腺癌細胞的抑制增殖和促凋亡作用。

近年來，越來越多的lncRNAs不僅被發現在多種腫瘤中表達異常，而且對腫瘤進程的影響頗深。GAS5(生長阻滯特異性轉錄因子5)屬于長鏈非編碼RNA，位于人類基因組1號染色體上，與腫瘤的發生發展過程密切相關[12]。作為一種抑癌基因，GAS5可通過影響多種基因組轉錄和信號傳導途徑而參與腫瘤的發生發展和耐藥性。已有研究顯示，GAS5通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌的血管生成和轉移[13]；GAS5通過調控PTEN表達影響肝癌細胞增殖和耐藥性[14]。Mourtada-Maarabouni等[15]研究首次報道，乳腺癌組織中GAS5轉錄水平顯著降低且發現GAS5在乳腺癌中被下調，其低表達水平表明乳腺癌患者的預后不良。有關GAS5在乳腺癌中的調控作用和機制也被報道，例如Zheng等[16]研究指出，GAS5可通過靶向miR-378a-5p/SUFU信號促進三陰性乳腺癌細胞的凋亡；同樣，我們課題組前期研究也發現，GAS5/miR-221-3p/DKK2軸可通過Wnt/β-Catenin信號通路調節乳腺癌細胞對ABCB1介導的阿霉素耐藥性[17]。這提示我們GAS5將成為一個有潛力的乳腺癌治療靶點。

近年來，有關中藥調控GAS5的癌癥研究層出不窮。Chen等[6]研究發現，傳統中藥補骨脂寧可通過靶向GAS5從而抑制肝癌細胞的發生發展；姜黃素通過抑制致癌的MAPK和PI3K/PKB信號通路上調GAS5，從而促進乳腺癌細胞的凋亡[7]。這些研究為我們的實驗奠定了良好的理論基礎并提供了一個新思路。有趣的是，本文實驗結果發現槲皮素可促進MCF-7細胞中GAS5的表達。

Notch1是一種跨膜蛋白，可作為配體激活的轉錄因子。配體-受體相互作用引起Notch1細胞外結構域的切割，使胞內的Notch1(ICN1，Notch1的活化形式)從膜中釋放并轉移到細胞核，從而促進其下游靶基因的轉錄。Notch1通路是一種重要的促癌信號通路，在乳腺癌中表達上調。Hu等[18]研究揭示，馬錢子堿通過抑制Jagged1/Notch1信號通路激活來抑制乳腺癌細胞骨轉移。本文實驗結果均表明了槲皮素不僅能在mRNA水平，而且可在蛋白水平上均抑制Notch1信號通路相關蛋白的表達，驗證了槲皮素對Notch1信號通路的抑制作用。此外，目前已有研究指出GAS5與Notch1之間的強相關性并且表明GAS5可通過調控Notch1信號通路調節疾病的發生發展。Chen等[9]研究發現，GAS5作為與miR-137競爭的內源性RNA通過調控Notch1信號通路從而調節缺血性卒中；Zhao等[10]研究指出，GAS5敲低抑制腦梗死大鼠神經元凋亡可能與Notch1信號通路的激活有關。這些研究讓我們產生了新的思考，槲皮素是否能通過靶向GAS5而阻止Notch1促癌信號通路的激活，從而誘導乳腺癌細胞凋亡。我們通過沉默GAS5與槲皮素共處理后發現GAS5與Notch1信號通路之間的強相關性，進一步證明槲皮素是通過靶向GAS5/Notch1信號通路從而促使乳腺癌細胞的凋亡。不足的是，本文研究尚未開展體內實驗進一步驗證。因此我們課題組后續將采用裸鼠乳腺癌移植瘤模型進行相關研究，以探索和完善槲皮素在體內的作用及其機制。

綜上所述，本研究證實了槲皮素抑制人乳腺癌細胞MCF-7細胞的增殖并誘導其凋亡，并表明了槲皮素可通過靶向GAS5/Notch1信號通路發揮其抑癌作用。這對乳腺癌的早期診斷、預后和治療具有參考價值，為乳腺癌的臨床用藥開拓了新的治療方案思路，但其具體機制還有待于進一步驗證與闡明。