沙庫巴曲纈沙坦通過逆轉高血壓大鼠心房結構重塑降低房顫易感性

李 倩，李 昕，李路安，周慧珊，彭德威，張夢珍，王釗煜，鄺素娟，鄧春玉，饒 芳，吳書林

(1.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內科，廣東省人民醫院醫學研究部，廣東省醫學科學院，廣東 廣州 510080)

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的心律失常之一，可導致血栓栓塞和心力衰竭,使患者致死致殘[1]。但目前AF的治療仍有很多局限性，藥物治療副作用多，導管治療有一定的復發率，而且僅在大型臨床中心可以進行[1]。因此，尋找新的治療藥物顯得非常重要。高血壓是AF的獨立危險因素之一,合并高血壓可顯著增加AF發生率[2]。目前高血壓的治療率和控制率仍遠未達理想，需進一步闡明高血壓導致AF的病理機制和尋找新的治療策略。

心房結構重塑是AF的重要發病機制之一，主要表現為心房間質組織增生和纖維化增多，進而使心房傳導異常，產生心房折返通路，導致AF易感性增加[3]。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)在心房局部組織中的激活，可促進心房的結構和電生理重塑，增加房性心律失常的敏感性[4]。近年研究表明，抑制RAS激活可以減輕心房重構，從而改善AF的發生和發展[5-6]。我們的前期研究也證實，纈沙坦(valsartan，Val)作為一種AT1受體(angiotensin Ⅱ- angiotensin type 1 receptor，AT1R)抑制劑，可抑制自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心房組織中的RAS，進而降低AF易感性[7]。而腦啡肽酶抑制劑可以減輕血管收縮、鈉儲留和適應機體不良重塑時的神經激素激活，進而補充和增強抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的作用[8]。沙庫巴曲纈沙坦 (sacubitril/valsartan，Sac/Val，LCZ696)，作為由纈沙坦和腦啡肽酶抑制劑前藥沙庫巴曲(AHU377)等摩爾比例組成的超分子復合物，可以高選擇性抑制AT1受體和腦啡肽酶(中性內肽酶，NEP)[8-9]。近年來，LCZ696在臨床上被推薦用于慢性心衰的治療，并發現其可通過改善心衰患者的左室重塑來減少室性心律失常的發生[10]。動物實驗亦發現，沙庫巴曲纈沙坦顯著減輕兔子心梗后纖維化，減少心室重構[11]。此外，沙庫巴曲纈沙坦可以改善壓力負荷誘導小鼠的纖維化，進而改善左心房功能[12]。但其是否可防治高血壓所致的AF，以及其機制是否通過抑制心房纖維化來減少AF的發生，尚未見相關報道。因此，本研究中，我們擬探究沙庫巴曲纈沙坦是否可能通過抑制SHR心房中的RAS，減輕纖維化，逆轉結構重構，進而降低AF易感性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組7周齡，♂,SPF級SHR 24只、Wistar大鼠8只(對照組)，購自北京維通利華，生產許可號為SCXK(京)2016-0006，質量檢測單位為中山大學實驗動物中心。經中山大學實驗動物倫理委員會審核(SYSU-IACUC-2020-000220)。將SHR隨機分為3組，分別為SHR組、SHR+Sac/Val組(30 mg·kg-1·d-1)和SHR+Sac/Val組(60 mg·kg-1·d-1)，以及對照組Wistar大鼠，連續灌胃給藥8周，每日1次。

1.2 主要試劑和儀器Ⅰ型膠原蛋白α1鏈( collagen type Ⅰ α1 chain，Col1A1，GR3334458-1) 、抗Ⅲ型膠原蛋白α1鏈( collagen type Ⅲ α1 chain，Col3A1,GR3272398-8)、ACE-1、ACE2和angiotensin抗體(Abcam)；AT1-R抗體(Santa Cruz)；抗TGF-β抗體(Cell Signaling Technology)；MMP9抗體(Millipore)；GAPDH抗體(Proteintech，075501)；RIPA裂解液(Beyotime Biotechnology，3228972)。鼠尾無創血壓計(IITC Life Science)，iWorx 數據采集和分析系統，8級心電導管(1.6F)(iWorx Systems)，小動物溫控加熱墊(RDW Life Science)，高速冷凍離心機(Beckman Coutler Allegrax-64X)，超靈敏化學發光成像儀(GE ImageQuant LAS500)。

1.3 方法

1.3.1大鼠血壓和體質量測定 使用IITC大鼠無創血壓計測量尾動脈血壓。利用固定器將大鼠固定，鼠尾置于感應器中，放入裝置內待其安靜且溫度升至32 ℃后，點擊啟動按鈕測量血壓。3次測量大鼠血壓并取均值。分別在給藥前(7周齡)及給藥8周后(15周齡)測定各組每只大鼠的血壓。并在給藥期間每周測量大鼠體質量，根據體質量調整給藥劑量。

1.3.2大鼠心房快速起搏 將大鼠稱重，麻醉，腹腔注射3%(45 mg·kg-1)戊巴比妥鈉，將其固定于小動物溫控加熱墊，溫度維持在37 ℃-38 ℃。備皮，局部消毒。記錄到體表心電圖后進行頸靜脈置管，沿鞘管送入電極導管至右心房。待記錄到腔內心電圖后，進行快速起搏，測定起搏閾值和采用心房爆發式(Burst)模式記錄AF的誘發率，AF持續時間和竇房恢復時間(SNRT)等。

1.3.3HE染色和Masson染色 動物處死后，取左心房組織，4%多聚甲醛固定，常規包埋、制片后脫蠟、脫水，分別進行HE染色和Masson染色，樹膠封片。使用相同參數在光學顯微鏡(×400)下進行圖像隨機采集分析。

1.3.4Western blot實驗 取綠豆大小的大鼠左心房組織，加入PBS緩沖液清洗殘留血液后吸去液體，用眼科剪將組織剪碎。加入200 mL含蛋白酶抑制劑(1 ∶100)的RIPA裂解液，冰上裂解30 min后用電動轉子研磨為勻漿，冰上靜置20-30 min后12 000 r·min-1離心，15 min，取上清棄沉淀。BCA法測定蛋白濃度，30 μg 樣本用4×上樣緩沖液(TaKaRa) 稀釋，40 ℃或100 ℃加熱10 min，將蛋白變性。用10% SDS-PAGE分離蛋白，恒壓80 mV電泳30 min 后轉100 mV 電泳。將蛋白轉至PVDF膜，恒流200 mA 轉膜2 h 。用TBST配制5%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h 或室溫封閉1 h ，加入對應的一抗[目的蛋白(1 ∶1 000),GAPDH(1 ∶10 000)]，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次/5 min。用5% 脫脂奶粉稀釋抗兔或抗鼠Ⅱ抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育2 h 或室溫孵育1 h后TBST洗膜3次/5 min。ECL試劑盒顯影蛋白條帶，使用軟件ImageJ測量蛋白灰度值，并計算目的蛋白與內參灰度值的比值，進行統計分析。

2 結果

2.1 大鼠血壓的變化如Tab 1所示，給藥前即7周齡的SHR收縮壓，平均血壓和舒張壓都相較Wistar 明顯升高(P<0.01) 。干預8周后，SHR組血壓仍比Wistar 組明顯升高(P<0.01)，給藥8周后，雖然血壓未降至正常，但收縮壓、平均血壓和舒張壓均明顯降低(P<0.01)，且SHR+Sac/Val 組血壓降低效果明顯優于SHR+Val 組(P<0.01)。以上結果表明，沙庫巴曲纈沙坦可以降低SHR血壓，且效果優于纈沙坦。

2.2 對大鼠左心房病理學的影響HE染色和Masson染色結果顯示，Wistar組心房肌細胞大小正常，細胞排列規則，纖維化不明顯;與之相比，SHR組心房肌細胞肥大明顯，可見肌絲斷裂，纖維化程度明顯加重。而與SHR組相比，SHR+Val 組和SHR+Sac/Val 組細胞肥大程度有所減輕，且心房肌細胞排列趨于整齊，纖維化明顯減輕，并以SHR+Sac/Val 組效果更為明顯，見Fig 1a和b。

2.3 大鼠房顫易感性的變化快速起搏心房觀察AF的可誘發率，結果發現，與Wistar組相比，SHR組AF誘發率明顯升高(P<0.01)；而與SHR 組相比，兩個給藥組AF誘發率明顯降低，且SHR+Sac/Val 組降低效果明顯優于SHR+Val組(P<0.01)(Fig 2，Tab 1)。各組的AF持續時間結果類似于AF誘發率，SHR組AF持續時間延長，給藥后縮短，但各組間差異無統計學意義。SHR組與Wistar組相比，竇房結恢復時間SNRT(ms)明顯延長(P<0.05)，給藥后SRNT有不同程度的縮短，且SHR+Sac/Val 組較SHR+Val 組縮短更明顯(P<0.01)。同時，CSNRT結果與SNRT結果一致，但差異無統計學意義。與Wistar組相比，SHR組的P波時限PWD(ms)和PR間期都有明顯延長(P<0.05)，給藥后均有不同程度的降低，但差異無統計學意義。以上結果表明，沙庫巴曲纈沙坦可以降低SHR的AF易感性，且效果優于纈沙坦。

Tab 1 Effect of Sac/Val on SHR blood and AF

2.4 對大鼠左心房組織RAS相關蛋白的影響為了觀察RAS在其中起的作用，我們對大鼠左心房組織中RAS相關蛋白的表達進行了檢測，根據Western blot結果顯示，SHR 組心房組織中ACE-1和angiotensin蛋白表達明顯上調(P<0.05)，給予纈沙坦和沙庫巴曲纈沙坦后，上述蛋白及AT1R蛋白表達均有不同程度的下調，且SHR + Sac/Val組下降更為明顯 (P<0.05)。此外，SHR心房組織ACE2蛋白表達明顯下調(P<0.05)，沙庫巴曲纈沙坦治療后明顯上調(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Pathological changes of left atrium observed by HE staining and fibrosis of left atrium determined by Masson staining(×400)(a) HE staining;(b) Masson staining

Fig 2 Representative electrophysiology results for atrial rapid pacing in Wistar rats and SHR groups(A) Typical baseline surface electrocardiogram (ECG) and intra-atrial electrocardiogram (IAEG).(B) Typical surface ECG recordings of sinus node recovery time (SNRT) following a 30-s Pacing train.(C) Typical surface ECG recordings of rats maintaining sinus rhythm after atrial burst Pacing.(D) AF incidence in Wistar (n=8),SHR (n=8),SHR+Val (n=8) and SHR+Sac/Val (n=8) groups.**P<0.01 vs Wistar rats;&&P<0.01 vs SHR;##P<0.01 vs SHR+Val.(E) Typical surface ECG recordings of rats with AF that spontaneously reverted to sinus rhythm.(F) Typical disorganized atrial wave (f wave).

2.5 對大鼠纖維化程度的影響同時，對大鼠左心房組織進行Western blot檢測纖維化指標。如Fig 4所示，與Wistar大鼠相比，SHR 組心房組織中纖維化蛋白Col1A1、Col3A1、TGF-β和MMP 9均明顯上調(P<0.05)，給藥后，兩種藥物使上述纖維化蛋白有不同程度的下調，且以LCZ696效果更明顯(P<0.05)。提示纈沙坦和沙庫巴曲纈沙坦均可使SHR心房纖維化程度明顯減輕，但沙庫巴曲纈沙坦的效果優于纈沙坦。

Fig 3 RAS related proteins expression in left atrial tissues of Wistar rats and SHR groups (A) Representative Western blots of ACE-1,ACE2,angiotensin and AT1R protein in left atrial tissues of Wistar rats,SHR,SHR+Val and SHR+Sac/Val.GAPDH was the internal control.(B) Densitometric analysis of ACE-1,ACE2,angiotensin and AT1R protein in left atrial tissues of Wistar rats,SHR,SHR+Val and SHR+Sac/Val(n=6-8).(*P<0.05,**P<0.01 vs Wistar rats;&P<0.05,&&P<0.01 vs SHR;#P<0.05 vs SHR+Val)

Fig 4 Fibrosis related protein expression in left atrial tissues of Wistar rats and SHR (A) Representative Western blots of Col1A1,Col3A1,TGF-β and MMP 9 protein in left atrial tissues of Wistar rats,SHR,SHR+Val and SHR+Sac/Val.GAPDH was the internal control.(B) Densitometric analysis of Col1A1,Col3A1,TGF-β and MMP 9 protein in left atrial tissues of Wistar rats,SHR,SHR+Val and SHR+Sac/Val (n=6-8).(*P<0.05,**P<0.01 vs Wistar rats;&P<0.05,&&P<0.01 vs SHR;#P<0.05,##P<0.01 vs SHR+Val)

3 討論

本研究結果表明，沙庫巴曲纈沙坦可以通過下調ACE-1，angiotensin和AT1R的蛋白表達，抑制SHR心房的RAS激活；并可使Col1A1、Col3A1、TGF-β和MMP9蛋白表達下調，改善大鼠心房纖維化，逆轉結構重構，減少AF的發生，且效果優于纈沙坦。

沙庫巴曲纈沙坦是由血管緊張素受體拮抗劑-纈沙坦和腦啡肽酶抑制劑前藥-沙庫巴曲1 ∶1比例組成的超分子復合物，每100 mg中含纈沙坦51 mg和沙庫巴曲49 mg，其可以高選擇性地抑制AT1受體和腦啡肽酶[8-9]。近年來被認為是慢性心衰藥物治療的重大突破[10]。本研究結果顯示，纈沙坦和沙庫巴曲纈沙坦可有效降低SHR的血壓，且沙庫巴曲纈沙坦降壓效果更優。沙庫巴曲纈沙坦鈉通過LBQ657(前藥AHU377的活性代謝產物)抑制NEP，同時通過纈沙坦阻斷AT1受體。通過LBQ657増加腦啡肽酶所降解的肽類水平(例如利鈉肽)，纈沙坦可通過選擇性阻斷AT1受體抑制血管緊張素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)作用，還可抑制Ang-Ⅱ依賴性醛固酮釋放。因此沙庫巴曲纈沙坦在抑制RAAS的同時可調節利鈉肽系統，從而增強血管舒張，降低血壓[8]。然而單獨抑制腦啡肽酶不會引起臨床上有意義的血壓降低，因為會引起依賴腦啡肽多肽血管的收縮劑如Ang-Ⅱ的增加。纈沙坦作為AT1受體的抑制劑，還能阻斷NEP抑制后NPs水平升高所引起的反射性RAAS激活[13]。臨床研究也證實，沙庫巴曲纈沙坦劑量依賴性降低患者血壓，且效果優于纈沙坦[9]。

慢性心衰治療的大型臨床研究結果顯示，沙庫巴曲纈沙坦可通過減輕左室重塑減少室性心律失常的發生[10]。動物實驗也發現，與獨立的腦啡肽酶抑制劑或血管緊張素受體阻滯劑相比，沙庫巴曲纈沙坦對心臟纖維化和心臟肥大有明顯抑制作用，可減輕大鼠心肌梗死后的心臟重構和功能障礙[14]。以及在糖尿病小鼠心衰模型中，沙庫巴曲纈沙坦可通過抑制TGF-β，減少纖維化，改善心臟功能。并且該作用可能是由于腦啡肽酶的特異性抑制，而沙庫巴曲纈沙坦中的纈沙坦不起作用[15]。但沙庫巴曲纈沙坦對高血壓所致的心房纖維化和房性心律失常的作用尚未見相關報道。

體內RAAS激活導致Ang-Ⅱ增加，刺激纖維化因子生成增加，導致心房結構重構和電重構，進而使AF易感性增加[4]。動物實驗發現，選擇性心臟過度表達ACE小鼠血漿Ang-Ⅱ濃度增加，心房擴張，纖維化和AF敏感性增加。而使用RAAS抑制劑可以使Ang-Ⅱ表達減少，抑制纖維化因子生成。有研究發現，SHR予坎地沙坦治療后，可降低Ang-Ⅱ水平，抑制TGF-β1的表達，減少纖維化的作用[16]。本研究發現，纈沙坦和沙庫巴曲纈沙坦均可明顯改善SHR的心房纖維化，以及明顯降低AF的可誘發率，且沙庫巴曲纈沙坦效果優于纈沙坦。這可能與沙庫巴曲纈沙坦同時增強其他肽類物質的作用有關，尤其是神經肽(NPs)和腎上腺髓質素(ADM)，兩者發揮很強的利尿鈉，利尿和血管擴張作用，并具有抗增殖和抗肥大作用[13]。此外，NPs系統中的CNP和BNP似乎在涉及鳥苷酸環化酶-C受體(NPR-C)的心臟成纖維細胞中具有重要的抗增殖作用[17]。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦作為血管緊張素受體和腦啡肽酶抑制劑，與AT1受體抑制劑纈沙坦相比，能更好地抑制心房RAS的激活，從而表現出更好的抑制纖維化作用，在防止高血壓所致AF中具有很好應用前景。