加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠RANK／RANKL信號通路的影響

陳 虹，洪妍妍，陳 敏，鄭 京*

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州350004；2.安溪縣中醫院，福建 安溪362400）

腎病綜合征根據病因可分為原發性和繼發性，臨床特征是大量蛋白尿、高度水腫、高脂血癥和低蛋白血癥。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起關鍵作用，NF-κB的錯誤調節可引發自身免疫病、慢性炎癥等許多疾病。激素是治療腎病綜合征的首選藥物，研究表明激素與機體的激素受體結合，抑制NF-κB進入細胞核，達到治療作用［1］。然而，激素治療的同時也產生了許多不良反應，比如骨質疏松、高血壓等等。中藥治療腎病綜合征可以減少病情反復、保護腎功能、預防并發癥，具有西藥不可取代的優勢，但其具體機制仍需進一步探討。阿霉素腎病作為經典的實驗性腎病模型，通過阿霉素尾靜脈注射使腎小球足細胞骨架蛋白及基底膜損傷，腎小球濾過功能受損，表現為大量蛋白尿［2］。腎病蛋白（nephrin）是足細胞裂孔膜的跨膜蛋白，是足細胞膜上重要的信號分子［3］。局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種非受體性的酪氨酸激酶，FAK活化可引起腎小球損傷，FAK磷酸化（p-FAK）后可影響足細胞α-actin骨架以及細胞黏附功能，而敲除FAK可改善足突融合且降低蛋白尿［4］。核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κBligand，RANKL）可激活MAPK信號通路［5］。P38是一種蛋白激酶，研究顯示腎小管細胞的凋亡與P38關系密切，P38磷酸化（p-P38）可活化NF-κB，對足細胞結構造成破壞［6］。已有研究表明腎組織中有Rank、RankL的存在［7］，本研究觀察激素、加味四君子湯能否抑制阿霉素腎病大鼠FAK、RANK、RANKL、P38MAPK的激活，使NF-κB入核減少，減少Nephrin的凋亡，達到減少蛋白尿的目的。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性大鼠40只，6～8周齡，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（閩）2014-0005，由福建中醫藥大學實驗中心鼠類實驗室飼養，動物合格編號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 中藥湯劑 加味四君子湯為國家“十一五”重點專科“水腫”（原發性腎病綜合征）驗證方案處方之一，根據李學銘先生所擬“加味四君子湯”加減而來［8］。組成：黃芪30 g，黨參10 g，丹參15 g，山茱萸10 g，山藥20 g，茯苓10 g，薏苡仁20 g，當歸15 g，蓮子30 g，金櫻子15 g，桑寄生15 g，白術10 g。原藥材由福建省藥材公司提供，福建省人民醫院制劑室加工制作。中藥制法：①稱取上述1劑中藥（共200 g），加冷水沒過中藥，浸泡30 min后以武火加熱至沸騰，改以文火煎煮30 min，過濾，得濾液；②次煎加水沒過濾渣，以武火加熱至沸騰，改以文火煎煮20 min，過濾，得濾液；③將2次濾液混合，以武火加熱濃縮至體積為200 mL，相當于原生藥1.0 g／mL。

1.3 試劑及儀器 鹽酸阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司）；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（型號：KGP150）、凝膠阻滯分析（EMSA）檢測試劑盒（型號：KGS101）、ECL檢測試劑盒（型號：KGP1123）、Braford蛋白含量檢測試劑盒（型號：KGA801）均購自南京凱基生物科技發展有限公司；RIPA裂解液（型號：p0013b）、BCA蛋白測定試劑盒（型號：p0010S）、Western一抗稀釋液（型號：p0023a）、Western二抗稀釋液（型號：p0023d）、麗春紅染色液（型號：p0022）、超敏ECL化學發光試劑盒（BeyoECL Plus，型號：p0018）均購自上海碧云天生物技術有限公司；ExScriptTMRT Reagent Kit試劑盒（型號：DRR037A）、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（型號：DRR820A）、Total RNA提取試劑（RNAiso Plus，型號：D9108A）均購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗大鼠Nephrin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；PV兩步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑（美國GBI公司，型號：PV9001）。

1.4 造模、分組及用藥 將40只SPF級雄性大鼠，以隨機數字表法分為正常組8只和造模組32只。造模組大鼠經尾靜脈一次性注射鹽酸阿霉素6.5 mg／kg［9］，正常組經尾靜脈一次性注射等劑量生理鹽水，注射后7 d檢測大鼠24 h尿蛋白定性，結果顯示24 h尿蛋白++或以上，表示造模成功［10］。造模組造模成功后采用隨機數字表法分為模型組、激素組、中藥組、聯合組各8只。正常組和模型組大鼠每日以20 mL／（kg·d）生理鹽水灌胃，激素組大鼠每日以潑尼松10 mg／（kg·d）灌胃，中藥組每日以加味四君子湯20 mL／（kg·d）灌胃，聯合組每日以加味四君子湯20 mL／（kg·d）和潑尼松10 mg／（kg·d）聯合灌胃，每日1次，連續灌胃28 d。

1.5 觀察指標 灌胃28 d以股動脈放血處死大鼠，取出腎臟，腎皮質組織保存于10%福爾馬林，其余腎組織凍存于液氮中，后轉至冰箱-80℃保存。

1.5.1 24 h尿蛋白定量 分別在灌胃第7天、第14天、第28天用個體代謝籠收集大鼠24 h尿液樣本，采用雙縮脲比色法測定24 h尿蛋白定量。

1.5.2 腎組織病理形態學 腎皮質組織用3%戊二醛、0.22 mmol／L蔗糖的磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）固定，1%鋨酸后固定，逐級乙醇脫水，環氧樹脂包埋及聚合、修塊、切片，超薄切片后染色，于日立HU-12A型透射電鏡下進行腎組織病理形態學檢查。

1.5.3 實時熒光定量檢測FAK、P38、RANK、RANKL、Nephrin mRNA表達水平 取腎皮質組織，TRIzol法抽提取總RNA，用ExScriptTMRT Reagent Kit試劑盒將其逆轉錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行熒光擴增。采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法，引物設計根據Genebank序列，由寶生物工程（大連）有限公司合成目標引物。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s，60℃延伸1 min，40個循環，GAPDH作為內參照。以正常組mRNA的表達量作為“1”，再根據校正值計算出其他各組mRNA相對含量，進行組間相對量的比較。各基因引物序列和產物長度見表1。

1.5.4 Western blot檢測FAK、P38、RANK、RANKL、Nephrin蛋白相對表達水平 腎組織稱量后放入勻漿器中剪碎，按1∶10比例加入相應的裂解液進行勻漿，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入buffer，100℃變性后，取20μg電泳，轉膜，5%BSA封閉液室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，次日加入HRP標記的二抗，室溫孵育l h，TBST充分洗滌，麗春紅染色后，用增強的化學發光系統檢測標本膜上的信號。

1.5.5 EMSA法檢測NF-κB 將腎組織剪切成小塊，加入適量的冰冷PBS均漿后，靜置取上清轉移至離心管中上清，分次加入Buffer A、Buffer B，渦旋振蕩，4℃離心后將上清轉入另一預冷的潔凈微量離心管，即得胞漿蛋白；在離心沉淀物（細胞核）中加入Buffer C，間斷渦旋后離心后取上清液，即得核蛋白；用Braford法對提取的胞漿蛋白和核蛋白進行蛋白定量；配制6.5%的聚丙烯酰胺凝膠；超純水5μL、EMSA／Gel-Shift結合緩沖液（5X）2μL、細胞核蛋白或純化的轉錄因子2μL、標記好的探針1μL配置成10μL樣品，并設置陰性對照組，加入1μL EMSA／Gel-Shift上樣緩沖液；用0.5XTBE作為電泳液，把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內；在多余的某個上樣孔內加入10μL稀釋好的1X的EMSA／Gel-Shift上樣緩沖液（藍色），按照10 V／cm的電壓電泳，制備電轉膜，干膠后使用凝膠成像系統成像。

1.5.6 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布的以（±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用卡方檢驗；等級資料采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1 5組24 h尿蛋白定量比較 見表2。

表2 5組24 h尿蛋白定量比較（±s）mg

表2 5組24 h尿蛋白定量比較（±s）mg

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05；與灌胃第14天比較，3）P＜0.05。

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2.2 5組腎組織病理形態學比較 電鏡下觀察見：正常組足突清晰，排列整齊，未見融合及微絨毛變性；模型組足細胞腫脹，足突增寬、部分或彌漫性融合；各用藥組較模型組腎小球病變明顯減輕，僅見足突部分融合。見圖1。

2.3 5組FAK、P38、RANK、RANKL、Nephrin mRNA表達水平比較 見表3。

圖1 5組腎組織病理形態學比較（×400）

表3 5組FAK、P38、RANK、RANKL、Nephrin mRNA表達水平比較（±s）

表3 5組FAK、P38、RANK、RANKL、Nephrin mRNA表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與灌胃第14天比較，4）P＜0.01。

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2.4 5組FAK、p-FAK、P38、p-P38、RANK、RANKL、Nephrin蛋白相對表達水平比較 見圖2、圖3。

2.5 5組NF-κB水平比較 見表4、圖4。

3 討 論

灌胃第14天和第28天，各用藥組24 h尿蛋白均較模型組降低，其中激素組降尿蛋白最優，其次分別為聯合組、中藥組，說明中藥組較激素組降尿蛋白的作用較為緩慢。

FAK是一種黏著斑蛋白，磷酸化后的FAK，通過Ras／MAPK和磷酸肌醇3激酶信號通路調控足細胞肌動蛋白細胞骨架的形成和細胞黏附功能，FAK激活引起足細胞遷移和活動性明顯，導致足突融合、蛋白尿增多［11］。RANK／RANKL信號通路也參與腎臟疾病的發生與發展，RANK／RANKL表達增加加重腎臟足細胞的損傷及蛋白尿的生成，RANK還可介導NF-κB信號通路，RANKL與RANK結合后誘導P38磷酸化刺激NF-κB形成NF-κB·IκB復合物，隨后將信號傳遞給TFRAB，TFRAB在IκB激酶（IKK）的作用下釋放NF-κB二聚體，使其與Ⅰ-κB分離并迅速進入細胞核，與MMP-2上NF-κB位點緊密結合，加速對大鼠腎小球基底膜的破壞，促進腎病發展［12］。而Nephrin是足細胞裂孔膜的跨膜蛋白，對維持腎小球濾過屏障起著關鍵作用，Nephrin的減少參與蛋白尿的發生。

圖2 5組FAK、p-FAK、P38、p-P38、RANK、RANKL、Nephrin蛋白相對表達水平比較

圖3 5組FAK、P38、p-FAK、p-P38、RANK、RANKL、Nephrin蛋白電泳表達

表4 5組NF-κB水平比較（±s）

表4 5組NF-κB水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與激素組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

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本試驗中模型組在阿霉素刺激造模成功后，與正常組比較，大鼠腎組織FAK表達增多，磷酸化后，RANK、RANKL蛋白表達增多，P38也被磷酸化（P＜0.01），與正常組比較，進入細胞核內的NF-κB也增多，Nephrin減少，尿蛋白增多（P＜0.01）。且隨時間推移，上述指標亦增多、尿蛋白增多。說明阿霉素對腎組織FAK、RANK、RANKL、P38這條道路被激活，導致足細胞Nephrin丟失增多、尿蛋白增多。證明了腎組織有RANK、RANKL的存在。阿霉素可損傷足細胞骨架，使足突融合、Nephrin丟失，同時炎癥反應加劇，NF-κB入核增多。經激素治療后，與模型組比較，FAK磷酸化減少，RANK、RANKL、P38均減少（P＜0.01），入核的NF-κB亦減少，Nephrin丟失減少，蛋白尿亦減少。

中藥組FAK、P38、RANK mRNA較激素組降低（P＜0.01），RANKL mRNA表達也同樣降低，表明中藥治療能抑制腎組織FAK、P38、RANK mRNA活性。然而中藥組FAK、P38、RANK、RANKL水平較激素組無統計學意義，Nephrin mRNA及蛋白表達也未優于激素組。但聯合組的FAK、RANK、RANKL、P38m RNA及蛋白表達均較激素組下降，Nephrin較激素組升高。以上結果共同說明激素組治療起效較中藥組快，故在灌胃第14天及28天中藥組尿蛋白水平高于激素組，而中藥和激素的共同應用能在一定程度上更好的逆轉FAK／RANK／P38通路的激活，減少Nephrin的損傷，從而減少尿蛋白。

中藥組可通過抑制FAK的磷酸化，達到降蛋白尿作用，雖然可控制RANK-RANKL表達、P38的磷酸化，但在控制NF-κB入核方面弱于激素組，因此，降蛋白尿方面弱于激素組。說明阿霉素還可通過其他途徑（如氧化應激）導致蛋白尿，而加味四君子湯尚未作用于此，或作用較弱。

本研究建立阿霉素腎病大鼠模型，予加味四君子湯和激素給藥后，Western blot和qPCR均提示RANK、RANKL、FAK、P38蛋白及mRNA表達降低，Nephrin表達增高，EMSA示NF-κB表達降低，同時尿蛋白水平也降低，提示加味四君子湯與激素均可通過抑制FAK／RANKL／RANK和RANKL／RANK／NF-κB信號通路降低腎損傷，減少尿蛋白。