羊毛角蛋白降解菌的篩選鑒定及液體發酵條件優化

龍宏燕　梁文英　陳風蔚　王睿勇

摘要：從長年堆積羊毛的土壤中篩選獲得3株具有角蛋白降解功能的菌株，經形態觀察和16SrRNA測序初步鑒定，并分別命名為鏈霉菌NJU-05、金黃桿菌NJU-07、地衣芽孢桿菌NJU-10。同時，進行液體發酵工藝優化，得到NJU-05菌株實驗室水平的最佳液體發酵條件：溫度為40℃，pH值為9.0，發酵周期為3d;NJU-07菌株：溫度為35℃，pH值為9.0，發酵周期為4d;NJU-10菌株：溫度為35℃，pH值為9.0，發酵周期為4d。

關鍵詞：羊毛角蛋白;液體發酵;工藝優化;降解菌;篩選鑒定

中圖分類號：S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0200-05

作者簡介：龍宏燕（1995—），女，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事應用微生物研究。E-mail：longhongyan1995@163.com。

通信作者：王睿勇，博士，副教授，主要從事應用微生物研究。E-mail：wangry@nju.edu.cn。

近年來，隨著養殖業的迅猛發展，和我國是革制大國的基本國情，會產生大量的羊毛、皮革加工廢棄物。有統計顯示，我國每年平均產生角蛋白類廢棄物的總量超過400萬t[1]，這些廢棄物由于難于加工且不易降解，大部分未得到合理利用。這類廢棄物大量堆積不僅會造成環境的嚴重污染，同時也是一種極大的資源浪費[2]。研究羊毛廢棄物的再生利用，不僅可以解決由它引發的環境污染問題，而且可以緩解我國蛋白質飼料的供需矛盾，同時在紡織、醫用生物材料、包裝等諸多領域都有廣闊的前景[3]。

國內外研究表明，微生物及其酶降解法是利用動物角蛋白最經濟有效的手段[4]，且對環境友好。微生物通過合成角蛋白酶降解角蛋白，其降解角蛋白過程大致可分為3個步驟：變性作用、水解作用和轉氨基作用[5]。目前，已發現30多種微生物具有降解角蛋白的功能，以細菌、真菌和放線菌為主，其中細菌主要有地衣芽孢桿菌、嗜熱菌、弧菌科細菌;放線菌中大多是鏈霉菌屬[6];真菌主要有長囊頭孢霉菌和皮膚癬菌[7]。

本研究旨在從土壤中分離純化出具有高效羊毛角蛋白降解能力的菌株，并對其液體發酵條件進行優化，為大量的廢棄羊毛提供方便高效實用的微生物利用途徑。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1羊毛粉未經酸堿處理的羊毛清水洗凈后在溫度為60℃條件下烘干至恒質量，粉碎機粉碎過篩后備用。

1.1.2培養基BM基礎培養基：1.500gK2HPO4、0.025gMgSO4·7H2O、0.025gCaCl2、0.015gFeSO4·7H2O、0.005gZnSO4·7H2O，1000mL蒸餾水，pH值為7.8～8.0。

羊毛分解能力測試培養基（篩選培養基）：在15mLBM基礎培養基中加入10根完整羊毛。

液體發酵培養基：50mLBM基礎培養基與0.5g羊毛粉一同裝入250mL錐形瓶中，滅菌備用。

1.2微生物的分離篩選

1.2.1采集樣品在宿遷市泗陽縣168鄉道新袁鎮山羊養殖基地，從羊圈表層、長期堆積羊毛廢棄物處、放牧的農用荒地及羊群活動的地方采集的4種土壤樣品。

1.2.2篩選分離富集培養：在15mLBM基礎培養基中加入1g土壤樣品及適量羊毛，在溫度為37℃條件下培養，觀察羊毛的降解情況。試管中的羊毛發生降解，且可溶性蛋白檢測有藍色反應，反復轉接，得到富集培養液。

初篩：取富集培養液分別在牛肉膏蛋白胨、高氏Ⅰ號及馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基的平板上稀釋涂布分離，挑選單菌落進一步純化后轉接斜面。37℃活化后，將活化菌接入測試管驗證其對羊毛角蛋白的降解能力，選取有降解能力的菌株保藏備用。

復篩：取1mL初篩得到的活化菌液接種于100mLBM基礎培養液中，于37℃、140r/min搖床培養5d。測定降解率、可溶性蛋白含量及角蛋白酶活性，分析各菌株對羊毛的降解能力。分析比對，從中挑選3株降解率最高的菌株，命名為NJU-05、NJU-07、NJU-10，接入斜面后保藏于4℃冰箱中，備用。

1.3菌種鑒定

分別對NJU-05、NJU-07、NJU-10的菌落進行形態學觀察、結合16SrRNA基因序列分析進行菌種鑒定。

1.4液體發酵條件優化試驗

于液體發酵培養基中分別接種，以培養溫度及培養基起始pH值作為主要的參數研究NJU-05、NJU-07、NJU-10對羊毛的降解，其中培養溫度分別設置為25、30、35、40、45℃;培養基起始pH值分別設置為6、7、8、9、10。

1.5發酵周期

在最適溫度和最適pH值條件下，140r/min搖床培養，每24h取樣1次，測定羊毛降解率、角蛋白酶活性、可溶性蛋白含量[8]，確定最佳發酵時間。

2結果與分析

2.1羊毛降解菌的篩選分離

2.1.1富集與初篩

采集的土樣進行富集培養后，通過初篩獲得50個生長良好的單菌落。將單菌落轉接入測試管，觀察發現隨著培養時間的延長，培養基的顏色逐漸加深，并出現沉淀。說明羊毛逐漸發生斷裂、降解。據此，篩選得到具有該現象較為明顯的18株菌，并根據所用培養基成分、菌落形態及鏡檢結果，初步判斷18株菌株中有7株為放線菌，9株為細菌，2株為真菌。

2.1.2復篩

初篩獲得的18株菌進一步發酵后，取發酵上清液測定可溶性蛋白含量，以及角蛋白酶活性。同時取濾渣烘干、稱質量，測定降解率。由圖1可知，編號為5、7、10的菌株有相對較高的降解率。編號為5的菌株降解率接近50%;7、10號降解率分別為37.59%、33.7%，超過其他菌株的降解率。同時，可溶性蛋白含量和角蛋白酶活性測定結果顯示5、7、10號菌株也表現出與降解率一致的結果，可溶性蛋白含量及角蛋白酶活性均高于其他菌株。5、7、10號菌株的發酵液中可溶性蛋白含量較高，均大于120μg/mL。因此本試驗選取角蛋白降解能力較高的3株菌5、7、10號作進一步研究，并將其命名為NJU-05、NJU-07、NJU-10。

2.2菌種鑒定結果

由表1可知，NJU-05油鏡下觀察菌絲發達，產孢子，為革蘭氏陽性菌;NJU-07菌體呈桿狀，無芽孢，為革蘭氏陰性菌;NJU-10菌體細胞呈短棒狀或桿狀，兩端為圓弧形，產橢圓形芽孢，革蘭氏染色后菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌。

16SrDNA測序結果與GenBank數據庫中發表的序列進行相似性比對后發現，該序列與天藍色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）A3（2）染色體相似性高達97%。NJU-07與黃桿菌科細菌（Flavobacteriaceaebacterium）3519-10同源性達到96%，GnenBank登錄號為NC_013062.1。16SrDNA測序結果顯示，NJU-10的16SrDNA基因約1.5kb，GenBank的登錄號為NC006322.1。序列比較分析顯示NJU10與地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）相似性達99%。

結合菌落形態及16srDNA的鑒定結果，認定NJU-05為鏈霉菌，NJU-07為金黃桿菌屬菌株，NJU-10為地衣芽孢桿菌。

2.3液體發酵工藝優化

2.3.1培養溫度對液體發酵的影響

由圖2可知，與對照組相比，NJU-05、NJU-07、NJU-10菌株隨發酵溫度升高角蛋白降解率逐漸上升，在溫度為35℃時，NJU-07、NJU-10降解率達到最高;在40℃時，NJU-05降解率達到最高。可溶性蛋白含量、角蛋白酶活性隨著溫度升高的變化趨勢與降解率一致。說明NJU-07和NJU-10于35℃液體發酵的最適溫度為35℃，NJU-05的最適溫度為40℃。低于或高于最適溫度，降解率、可溶性蛋白含量及酶活性均有所降低。

pH值也是影響液體發酵的一個重要因素。由圖3可知，在一定的pH值范圍內，隨著培養基起始pH值的升高，3株菌的降解率、可溶性蛋白含量及酶活性逐漸增加，pH值為9.0時，對3株菌所測定的3個指標均達到峰值，表明它們所產的角蛋白酶是堿性蛋白酶，且較高的堿性條件還能抑制雜菌生長。但過酸或過堿環境均會影響它們的角蛋白降解能力。

2.3.2發酵周期確定

由優化試驗可知所篩選出的3株菌在實驗室水平下液體發酵的最優條件，其中NJU-05的培養溫度為40℃，pH值為9.0;NJU-10的培養溫度為35℃，pH值為9.0。在此培養條件下，確定發酵周期。由圖4-a可知，NJU-05在發酵的前3d內，角蛋白酶活性及可溶性蛋白含量隨著時間的推移逐漸增多，在發酵后3d均達到最大值，[KG*8]從發酵后4d起兩者又逐漸下降，這可能是由于細菌生長受到環境和資源的抑制。角蛋白降解率從發酵后的1～6d呈持續上升趨勢，在發酵2～3d時，增幅最大，而后的幾天在此基礎上雖繼續降解，但增幅有所減小。所以，發酵周期以3d為宜。

由圖4-b可知，隨著發酵時間的延長，NJU-07的各項指標均在增加，在發酵4d時，角蛋白酶活性出現峰值，而后下降明顯。可溶性蛋白含量在發酵4d時達到峰值。羊毛降解率在發酵前4d增幅均較明顯，而在發酵5、6d時，增幅很小，所以，認為發酵時間為4d最合適。

由圖4-c可知，在接入NJU-10后，角蛋白酶活性在發酵3d時出現峰值，發酵4d時略有下降，發酵5、6d下降明顯。可溶性蛋白含量在發酵4d時增幅最大，且達到峰值。相應地，角蛋白降解率在發酵前4d增幅均較明顯，而在發酵5、6d時，增幅均小于5%，此時再繼續發酵已無多大意義。綜合各因素，認為發酵時間為4d最合適。

3結論與討論

從混有羊毛的土樣中，經富集培養和篩選分離得到3株具有較強羊毛角蛋白降解能力的菌株NJU-05、NJU-07、NJU-10。本研究考察液體發酵溫度和pH值對降解羊毛角蛋白的影響，以確定最優的發酵條件，獲得較高的羊毛角蛋白降解率。通過以上試驗表明，培養溫度為40℃，培養基起始pH值為9.0，發酵3d時，NJU-05產酶能力最強，降解羊毛角蛋白的效果最優;NJU-07實驗室水平的最佳液體發酵條件：溫度為35℃，pH值為9.0，發酵周期為4d;最適宜NJU-10的液體發酵條件：溫度為35℃，pH值為9.0，發酵周期為4d，降解率可達52.8%，在此條件下降解羊毛角蛋白最經濟有效，且在液體發酵過程中也發現，角蛋白酶活性與可溶性蛋白含量的變化及角蛋白的降解率變化有一定的對應關系。

本研究為角蛋白廢棄物的生物技術利用提供了理論依據。微生物降解羊毛為工業化利用開拓了更加經濟的途徑。如果將來能使微生物降解羊毛角蛋白形成一套系統工藝，角蛋白的循壞使用將實現，為此我們還需要對角蛋白酶進一步的純化，并對其理化性質進一步的研究，后續工作還有待于進一步深入。

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