淮稻5號化學誘變突變體庫的構建與基因快速定位

王迪　牛梅　王健　程保山　李剛　徐衛軍　袁彩勇

摘要：淮稻5號是江蘇地區粳稻主栽品種之一，該品種具有灌漿速度快、出糙率高、千粒質量高、抗倒能力強、耐低溫等特點。但由于缺少適宜的研究材料，淮稻5號中優良農藝性狀的調控機制一直沒有得到解析。突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一，本研究利用N-甲基-N-亞硝脲（MNU）化學誘變構建了包含3562個家系的淮稻5號突變體庫，并從中篩選獲得了512個表型穩定的突變體，包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等8種類型，利用MutMap技術完成了2個株型突變體的突變位點初步定位，該突變體庫的構建及MutMap技術的應用，以期為淮稻5號優良性狀的解析提供突變體資源。

關鍵詞：淮稻5號;MNU;突變體庫;MutMap

中圖分類號：S511.032文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0026-06

作者簡介：王迪（1988—），男，山東昌邑人，博士，助理研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：wangdirice@163.com。

通信作者：袁彩勇，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：hysdycy@163.com。

突變體和相對應的突變基因之間有直接的因果關系，對于基因功能的研究最具說服力，因此突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一[1-2]。但自然發生突變的頻率極低，高等生物的自發突變率為1×10-10～1×10-5，因此通過誘變方法獲得大量的突變體材料，構建水稻突變體庫，識別與鑒定突變性狀的變異基因，進而明確其功能，是水稻功能基因組學研究的重要途徑[3-5]。目前構建突變體的方法主要有插入突變、基因編輯、物理誘變和化學誘變等[6]。

插入突變是指將T-DNA[3，7-8]、轉座子系統[9-10]、逆轉座子[11-13]等DNA元件插入植物基因組中，破壞插入位點內基因的功能，同時DNA元件又可作為標簽協助從植物基因組中分離出相應基因?；蚓庉嬍且环N新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的基因工程技術，主要包括轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALEN）和成簇規律間隔短回文重復（CRISPR/Cas9）系統等方法[14-16]。物理誘變是指通過快中子、質子、γ射線、X射線等方法處理植物種子，對植物染色體造成損傷，進而誘發變異[5，17]?；瘜W誘變是指利用堿基類似物、烷化劑、嵌入劑等化學誘變劑處理種子或植株器官等誘發突變[18]。與其他方法相比，化學誘變具有操作簡單、成本較低、受試驗條件限制小、誘變效率高等特點。N-甲基-N-亞硝脲（MNU）是一種單堿基誘變劑，主要對DNA上的鳥嘌呤起烷化作用。Satoh等首次確立了利用MNU處理水稻受精卵的誘變方法，并指出MNU在水稻誘變中的效率高于甲基磺酸乙酯（EMS）[19]。

利用物理和化學誘變獲得的突變體，如果通過傳統圖位克隆的辦法定位突變基因，存在耗時長、效率低的缺點，極大地限制了理化誘變突變體庫的發展和利用。但隨著水稻基因組測序工作的完成以及二代測序技術的不斷發展，MutMap技術的出現極大地提高了水稻突變體基因的克隆效率。MutMap技術通過對F2分離群體中突變表型個體進行混池測序，而后與野生型基因組序列進行比對，進而發現突變基因。同時MutMap技術所需要的F2分離群體較小，因此減少了雜交工作量，非常適用于水稻理化誘變突變體庫的突變基因克隆[20]。

淮稻5號是江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所育成的遲熟中粳品種，該品種具有株型適宜、灌漿速度快、出糙率高、千粒質量高、抗倒能力強、耐低溫等特點[21]?；吹?號尤其適宜直播，直播中豐產性、抗逆性、穩產性和品質等綜合性狀均較好，自推廣以來一直占據江蘇省水稻品種市場重要份額，根據全國水稻數據中心統計，淮稻5號目前累計推廣面積超過175.2萬hm2（http：//www.ricedata.cn/variety/varis/604604.htm）。但由于缺少適宜的研究材料，淮稻5號優良農藝性狀的分子調控機制一直沒有得到解析。因此，構建淮稻5號的突變體庫，選取適宜的突變體材料解析調控淮稻5號株型、抗倒、灌漿快、耐低溫、高出糙率等優良性狀的分子機制，能夠為后續品種的開發提供新的基因資源和理論基礎。本研究利用MNU誘變構建淮稻5號的突變體庫，通過對3562個突變家系的篩選獲得了512個表型穩定的突變體。此外，利用MutMap技術對其中的2個矮桿突變體進行了突變基因的定位。該突變體庫以期為淮稻5號優良性狀的解析提供突變體資源，具有一定的生產意義和理論意義。

1材料與方法

1.1MNU誘變

2017年正季于江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所水稻育種基地選取分蘗較多、生長旺盛的淮稻5號盛花期植株進行MNU誘變，當天下午剪除已開花的穎花，第2天下午剪除未開花的穎花同時修剪多余分蘗及葉片，第2天23：00將預備的穗子浸泡在1mmol/L的MNU溶液中1h，之后用流水沖洗15min，第3天將處理過的植株種植于田間，自交結實獲得M1種子。

1.2突變體種植及篩選

收獲的M1種子同年冬天送至海南陵水南繁育種基地加代，單株收種獲得M2種子。2018年正季將M2種子種植于江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所水稻基地，每個M2家系種植30株。對M2家系進行全生育期篩選分離出有明顯突變表型的家系，出現突變植株的家系按單株分別收取突變植株與野生型植株的種子。對未分離出突變表型的家系單株收種磨米鑒定米質與出糙率。同時所有M2家系分家系混收一部分種子儲存于種子庫中。所有誘變材料均按正常大田條件管理，單株插秧。

1.3遺傳分析

hw5、hw7突變體與淮稻5號做正反交構建遺傳分析群體，同年冬季于海南陵水加代獲得F2種子，第2年正季將F2分離群體種植于淮安，成熟期統計F2群體中野生型表型和突變體表型植株數量，計算分離比，進行卡方（χ2）測驗。

1.4基因定位

從hw5×淮稻5號與hw7×淮稻5號的F2分離群體中分別取野生型表型單株和突變表型單株葉片各30個，分別提取DNA后，取等量混合形成DNA混池。采用MutMap方法克隆株型基因，獲得基因序列和突變位點信息，MutMap由成都天成未來科技有限公司完成。

2結果與分析

2.1突變體庫的創建和篩選

30株只保留當天開花穎花的淮稻5號植株經MNU處理后結實收獲M1種子，將M1種子種植于海南，共獲得M1植株4887株，其中完全不育的M1植株174株，分單株收種獲得M2種子。M2種子種植后共獲得M2家系3562個。對M2家系進行全生育期觀察，篩選株型、葉色、抽穗期、育性等方面的突變體材料，共獲得512個突變家系，包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等8種類型，占總家系數量的14.37%。其中株型突變體出現頻率最高，為203個，占總家系數量的5.70%;脆稈突變體出現頻率最低，為2個，占總家系數量的0.06%（圖1、表1）。

2.2株型突變體遺傳分析

為進一步了解本研究突變體庫的質量，從中選取hw5及hw72個株型突變體進行MutMap基因定位。其中hw5表型為半矮稈，hw7表型為矮稈、分蘗角增大（圖1-C、圖1-D、表2）。分別將hw5、hw7突變體與淮稻5號正反交，構建F2分離群體。2組試驗F1均表現為野生型表型，F2中出現野生型表型和突變體表型2種分離，分別統計各個F2群體中野生型表型和突變體表型植株的數量，進行卡方測驗。結果表明， hw5、hw7分離群體的分離比均符合3∶1（表3）。說明， hw5、hw7的表型均受隱性單核基因控制。

2.3MutMap定位

在hw5、hw7的F2（hw5/淮稻5號，hw7/淮稻5號）分離群體中，分別取野生型表型單株和突變表型單株葉片各30個，分別提取DNA后，取等量混合構建DNA池，利用MutMap方法克隆突變基因。根據SNP密度圖選擇SNP密度大的區域為候選區段（圖2），利用varBScore算法，將方差進行對數處理，獲得最顯著的變異連鎖區段，通過計算不同混池間各突變型的頻率距離，采用距離差異來反映標記與目標區域的連鎖強度，根據得到的混池間的SNP位點集及基因型的深度信息，計算不同混池間的突變頻率差異，最終獲得候選基因（表4）。

3結論與討論

本研究通過MNU誘變構建1個包含3562個家系的淮稻5號突變體庫，從該突變體庫中共篩選獲得512個突變家系，總誘變概率為14.37%。其中包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等多種類型，不同類型突變體出現的頻率為0.06%～570%。該突變體庫突變類型豐富，通過對該庫中相關突變體的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5號優良農藝性狀的分子調控機制，能夠為后續品種的開發提供新的基因資源和理論基礎。盡管已從該突變體庫中篩選獲得了大量突變體，但是介于篩選手段及試驗條件的限制，未能從該突變體庫中篩選到灌漿快、灌漿期耐低溫相關性狀的突變體，這意味著該突變體庫中仍然有大量未被篩選出的突變體，隨著篩選手段和試驗條件的改善，該突變體庫還有巨大的潛力可以挖掘。

MutMap技術基于近些年日趨完善的測序技術而產生，通過將突變群體的測序結果與野生型相對比，可以快速定位突變基因。為了滿足分子標記多態性的需求，傳統的圖位克隆一般采用秈粳雜交構建分離群體，所需分離群體數量大，且分離群體容易受到遺傳背景差異的影響從而增加表型判斷的難度。與傳統圖位克隆相比，MutMap所需群體較小，且定位群體遺傳背景一致，可以避免父母本之間遺傳背景差異的影響，降低基因克隆成本的同時，大大縮短了基因定位所需的時間。

本研究利用MutMap技術對hw5和hw72個株型突變體進行了基因定位。通過遺傳分析證明hw5和hw7的突變表型均受隱性單核基因控制，適用于通過MutMap的方法定位突變基因。通過將hw5、hw7與淮稻5號分別雜交后構建約300～400個單株的F2分離群體，從中分別篩選野生型表型和突變型表型單株各30個，提取DNA后等量混合構建混池，經過重測序和比對分析后獲得候選基因。其中hw5篩選獲得5個導致氨基酸序列變化的SNP位點，而hw7篩選到1個導致氨基酸序列變化的SNP位點，后續可以通過在分離群體中驗證突變位點是否與突變表型共分離獲得突變基因。

本研究利用MNU誘變獲得了包含3562個家系的淮稻5號的突變體庫，并從中篩選獲得512個突變家系。隨著篩選技術手段的改進，該突變體庫還有巨大的潛力可以挖掘。同時利用MutMap技術對hw5和hw72個株型突變體進行基因定位。借助MutMap技術，對該庫中相關突變體的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5號優良農藝性狀的分子調控機制，能夠為后續品種的開發提供新的基因資源和理論基礎。

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