苞葉雪蓮總黃酮提取工藝優化及其粗提物抗腫瘤活性

許地元　葉萍　李海麗　林鵬程

摘要：為了明確苞葉雪蓮總黃酮提取工藝及其粗提物各段位抗腫瘤活性，采用正交試驗優化苞葉雪蓮總黃酮提取工藝，再通過組蛋白去乙酰化酶抑制試驗初步評價苞葉雪蓮粗提物各段位抗腫瘤活性。結果確認提取苞葉雪蓮總黃酮的最佳料液比為1g∶25mL，乙醇體積分數為60%，提取溫度為60℃。苞葉雪蓮粗提物的正丁醇相對組蛋白去乙酰化酶具有較好的抑制作用，抑制率高達91.34%，說明苞葉雪蓮粗提物的正丁醇相可作為抗腫瘤藥物的篩選。

關鍵詞：苞葉雪蓮;總黃酮;正交試驗;組蛋白去乙?；?/p>

中圖分類號：R284文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0130-05

作者簡介：許地元（1996—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，主要從事藏藥功效及成分的研究。E-mail：xudiyuan.com@qq.com。

通信作者：李海麗，教授，主要研究方向為藥理學。E-mail：1164948799@qq.com。

苞葉雪蓮[Saussureaobvallata（DC.）Edgew.]為風毛菊屬雪蓮亞屬植物，別稱苞葉風毛菊，多年生草本植物，高16～60cm。其花為藍紫色，瘦果矩圓形，長5mm，花果期7—9月，生于高山草地、流石灘、溪邊石隙處、山坡多石處，生境海拔3200～4700m，是高原地區特有的一種植物，其性溫、微苦，清熱解毒、祛風除濕、通經活血[1]。藏醫將苞葉雪蓮用于風濕性關節炎、高山不適癥、月經不調、胎衣不下等癥[2]。在前期的預試驗中發現苞葉雪蓮中含有較多黃酮類化合物。黃酮類物質作為植物中廣泛存在的一類化合物，在醫藥領域應用廣泛。相關研究已經證明許多黃酮類成分對癌癥、腫瘤、抗衰老、心腦血管保護、抑菌等方面有明顯療效[3-5]。關于總黃酮的提取工藝已有多篇文獻報道[6-7]，但目前還沒有關于苞葉雪蓮總黃酮提取工藝優化及抗腫瘤方面的深入研究。本試驗采用正交試驗優化法探討各因素對苞葉雪蓮總黃酮提取率的影響，優化苞葉雪蓮總黃酮的提取工藝，同時對苞葉雪蓮粗提物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相進行了組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，HDACs）活性篩選，初步研究苞葉雪蓮的抗腫瘤活性。

1材料與方法

1.1儀器及試劑、材料

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;HH-6數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）;T6新世紀紫外-可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限責任公司）;XK96-3型微量振蕩器（泰州市姜堰區新康醫療器械有限公司）;酶標儀POLARstarOmega（德國BMGLABTECH公司）;384孔白色微孔板（Greiner#784075）;恒溫培育箱（上海躍進醫療器械廠）。

乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）;硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學試劑廠）;亞硝酸鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠）;氫氧化鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠）;DMSO（細胞培養級，索萊寶生物科技有限公司）;H3K9me0-Eu（K）抗體（CisbioBioassays）;鏈霉親和素XL-665（CisbioBioassays）;檢測緩沖液（CisbioBioassays）;HDAC1（SignalChem）;組蛋白H3（1-21）賴氨酸9乙?；锼鼗模ˋnaSpec）。

藏藥苞葉雪蓮于2019年8月采自青海省拉脊山，由青海民族大學藥學院林鵬程教授鑒別確定為藏藥材苞葉雪蓮[Saussureaobvallata（DC.）Edgew.]。試驗時間為2019年10月至2020年6月，試驗地點為青海民族大學藥學院。

1.2試驗方法

1.2.1苞葉雪蓮的總黃酮提取方法

稱取苞葉雪蓮藥材粉末1.00g于錐形瓶中，在一定的料液比、乙醇體積分數、提取溫度條件下，固定50Hz，60℃，超聲5min，回流提取時間70min，進行總黃酮的回流提取，抽濾，取出濾液，共提取2次，合并濾液并濃縮。

1.2.2總黃酮提取率的測定

1.2.2.1繪制蕓香苷標準曲線

用30%乙醇（體積分數，下同）將8.75mg蕓香苷對照品定容于25mL容量瓶中，搖勻，得質量濃度為0.35mg/mL的對照品溶液。用移液管吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL對照品溶液，分別置于規格為25mL的6個容量瓶中。加入30%乙醇10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5mL，搖勻。然后將1.0mL5%NaNO2加入其中，搖勻。4min后，將1.0mL10%Al（NO3）3加入其中，搖勻。10min后，將5mL1mol/LNaOH加入其中，搖勻。最后用30%乙醇定容，充分振搖。15min后，供測定使用。于500nm波長處測定吸光度，橫坐標為蕓香苷濃度C（mg/mL），縱坐標為相應的吸光度D，得標準曲線方程為：y=18.614x+0.0001，r2=0.9993。

1.2.2.2苞葉雪蓮總黃酮提取率的測定

用10mL50%乙醇將濃縮提取液溶解，用移液管準確吸取1mL溶液，置于50mL容量瓶中，按上述方法操作，測量吸光度。

n=[SX（]C×D1000m[SX）]×100%。

式中，n表示總黃酮的提取率，C表示根據吸光度值計算出的溶液濃度（mg/mL）;D表示溶液稀釋倍數;m表示藥材取樣量（g）。

1.2.3單因素試驗設計

1.2.3.1料液比對提取率的影響

準確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，乙醇體積分數60%，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），50Hz，60℃，超聲5min，然后在提取溫度60℃條件下，水浴回流提取70min，考察，計算提取率，每組試驗平行操作3次，取平均值。

1.2.3.2乙醇體積分數對提取率的影響

準確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，分別加入料液比1g∶25mL，乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的提取溶劑，50Hz，60℃，超聲5min，然后在提取溫度60℃條件下，水浴回流提取70min，計算提取率，每組試驗平行操作3次，取平均值。

1.2.3.3提取溫度對提取率的影響

準確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，料液比1g∶25mL，乙醇體積分數60%，50Hz，60℃，超聲5min，分別于40、50、60、70、80℃的提取溫度下水浴回流70min，計算提取率，每組試驗平行操作3次，取平均值。

1.2.4正交試驗設計

本試驗將影響苞葉雪蓮總黃酮提取率的料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取溫度（D）作為試驗因素，用正交試驗軟件設計試驗，選取L9（34），空出第3列為C因素作空白誤差分析，以提取率作為參考指標。具體因素及水平見表1。

1.2.5組蛋白去乙?；敢种圃囼灥臉悠芳叭芤号渲?/p>

組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，HDACs）是一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶，它與多種原癌基因和腫瘤抑制基因密切相關。HDACs過度表達并被轉錄因子募集，會導致特定基因被不正常抑制，從而導致腫瘤或其他疾病的發生[8-9]。HDACs抑制劑通過與鋅離子螯合競爭性地抑制HDACs的催化活性，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長[10]。HDAC1是HDACs的一種，位于細胞核內，調控組蛋白乙?；揎梉11-12]。

1.2.5.1苞葉雪蓮提取物的萃取

將苞葉雪蓮藥材粉碎（3.5kg），浸泡在一定體積的95%乙醇中24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏①。繼續將95%乙醇浸泡過的濾渣放入65%乙醇浸泡24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏②。繼續將65%乙醇浸泡過的濾渣放入去離子水中浸泡24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏③。將所得浸膏①②③合并得到苞葉雪蓮粗提物，用適量的水溶解。置于2000mL的分液漏斗中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，分別得到石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D。

1.2.5.2酶反應體系緩沖液的配制

緩沖液的配方為50mmol/LTris-HCl，pH值為8.4，0.137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，1mmol/LMgCl2，0.01%吐溫20。

1.2.5.3化合物溶液的配制

分別取石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D的干浸膏各0.4mg，分別溶解于100μL的DMSO中，超聲5min。再分別取1μL溶解樣品的DMSO，分別加入上述配制的緩沖溶液99μL，得到用于檢測苞葉雪蓮抗HDAC1酶有效提取物A、B、C、D濃度為40μg/mL的溶液。

1.2.5.4酶溶液的配制

將50μgHDAC1加入上述配制好的緩沖液稀釋為濃度為10ng/μL的酶溶液，備用。

1.2.5.5底物溶液的配制

組蛋白H3（1-21）賴氨酸9乙?；锼鼗腫H3（1-21）K9]的初始濃度為5mmol/L，加入上述配制好的緩沖液稀釋至濃度為0.5μmol/L，備用。

1.2.5.6抗體儲備液的配制

取H3K9me0-Eu（K）抗體40μL用檢測緩沖液稀釋50倍，備用。

1.2.5.7鏈霉素和素XL-665（SA-XL665）儲備液的配制

取濃度為16.67μmol/L的鏈霉素和素XL-66512μL，用檢測緩沖液稀釋166.7倍，備用。

1.2.6HDAC1酶存活率的測定方法

取“1.2.3.3”節制備的溶液A、B、C、D各4μL置于396孔板中，每組設3個復孔，再分別加入2μLHDAC1酶，室溫條件下反應5min，加入4μLH3（1-21）K9底物溶液，37℃，培養箱中培養60min。加入5μLSA-XL665儲備液和5μLH3K9me0-Eu（K）抗體儲備液，665nm測值，得試驗組吸光度。

將4μL的緩沖溶液置于396孔板中，再分別加入2μLHDAC酶，室溫條件下反應5min，加入4μLH3（1-21）K9底物溶液，37℃，培養箱中培養60min。加入5μLSA-XL665儲備液和5μLH3K9me0-Eu（K）抗體儲備液，665nm測值，得對照組吸光度。計算HDAC1酶存活率：

存活率=試驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.7數據統計分析

采用MicrosoftExcel2010、Origin2018、SPSS20.0、GraphPad6.0進行試驗數據處理、分析及繪圖。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1不同料液比對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖1可以看出，料液比在1g∶20mL之后，提取率變化不明顯。其主要原因可能是當料液比大于1g∶20mL之后，總黃酮大部分已經溶出，增大溶劑對體系作用不明顯，為節約提取成本，正交試驗中料液比因素水平為1g∶15mL、1g∶20mL、1g∶25mL。

2.1.2不同乙醇體積分數對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖2看出，提取劑濃度低于60%時，總黃酮的含量隨著乙醇體積分數的升高而增大，之后，提取率下降，這可能是因為苞葉雪蓮總黃酮的極性與60%乙醇最為相似，故濃度過低或過高都會降低總黃酮的溶出，與此同時增加了葉綠素等其他色素物質的溶出，干擾試驗。因此正交試驗中選擇乙醇體積分數因素水平為40%、50%、60%。

2.1.3不同提取溫度對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖3看出，提取溫度超過60℃，提取率隨著溫度的提升反而降低，可能是因為苞葉雪蓮中的黃酮類物質遇熱不穩定，結構分解，導致測量的總黃酮含量降低。而在40～50℃時，總黃酮提取率有明顯的提升，可能是溫度升高后，增加了物質的溶出速度。因此正交試驗選擇提取溫度因素的水平為50、60、70℃。

2.2正交試驗結果與分析

由上述單因素試驗結果可知3個因素對苞葉雪蓮總黃酮提取率的影響，每個因素選取3個水平，其中溫度為50、60、70℃，料液比為1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL），乙醇體積分數為40%、50%、60%。按照L9（34）進行正交試驗，空出第3列為C因素作空白誤差分析，因素水平見表1，正交試驗安排及結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2、表3可知RB>RA>RD，乙醇體積分數間存在明顯差異，最佳提取工藝為A3B3D2，即最佳提取工藝為料液比1g∶25mL，乙醇體積分數為60%，提取溫度為60℃。同時方差分析可以得出乙醇體積分數對提取結果具有顯著性影響，與極差分析結果一致。取A3B3D2條件試驗3次，結果取平均值，得到總黃酮的提取率為1.589%，說明該工藝所選的參數可行。

2.3苞葉雪蓮提取物抗HDAC1酶活性

由圖4可以看出，與對照組相比，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有顯著性差異（其中石油醚相P<0.05，乙酸乙酯相、正丁醇相、水相P<0.001）。以抑制HDAC1酶的能力為活性指標評價苞葉雪蓮的抗腫瘤活性，一般認為當HDAC1酶存活率低于50%時，具有明顯的抗腫瘤活性。由圖4結果可知，乙酸乙酯相、正丁醇相及水相均具有較好的抗腫瘤作用，其中正丁醇相抗腫瘤作用最佳，抑制率高達91.34%。

3討論與結論

3.1正交試驗設計的苞葉雪蓮總黃酮最佳提取工藝

在提取時間為70min的情況下，料液比1g∶25mL、乙醇體積分數60%、提取溫度60℃為苞葉雪蓮總黃酮的最佳提取工藝，得到總黃酮的提取率為1.589%。同時，各因素對總黃酮提取率的影響順序為乙醇體積分數>料液比>提取溫度。

3.2研究意義

癌癥是世界上最致命的疾病之一[13]。除了遺傳因素，癌癥的發生還涉及表觀遺傳修飾，包括DNA（甲基化和去甲基化）和組蛋白的共價修飾[14-15]。表觀遺傳調控通過相應的酶實現可逆的修飾過程。組蛋白賴氨酸乙?；绞芙M蛋白去乙?；福℉DACs）和組蛋白乙酰轉移酶（HATS）的調控，在表觀遺傳修飾中起著關鍵作用[16-19]。HDACs在不同的腫瘤中都有過表達[20]，組蛋白去乙?；敢种苿℉DACis）已被證明通過多種機制顯著抑制細胞增殖、血管生成和轉移[21]。到目前為止，在人類中已經發現了18種HDAC亞型，它們可以分為4類。Ⅰ類（1、2、3、8）、Ⅱ類（4、5、6、7、9、10）和Ⅳ（11）HDAC是依賴于Zn2+的酶，而Ⅲ類HDAC（SIRT1-7）的活性需要NAD+[22-24]。市場上已經批準了5種HDACis，即伏立寧（SAHA）、貝力寧（PXD101）、潘諾比妥（LBH589）、羅米地平（FK228）和氯氮酰胺（CS055）。然而，大多數HDACis對實體瘤的抗腫瘤效果并不理想，因此開發新型HDACis對實體腫瘤的高效抗腫瘤具有重要意義。

本試驗優化了苞葉雪蓮總黃酮提取工藝，確定了其最佳提取工藝，且利用組蛋白去乙酰化酶抑制試驗明確了苞葉雪蓮粗提物中萃取的乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有良好的抑制HDAC1酶的活性，其中正丁醇相抑制效果最好。后續可通過研究苞葉雪蓮的正丁醇相提取部位，開發出一種HDACs抑制劑，為抗腫瘤藥物的開發提供思路。

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