一種注射用溫敏型水凝膠的制備及特征分析

黃永娜　宣德春　梁榮　宋海鑫　苗晉鋒　張金秋

摘要：溫敏型水凝膠在藥物或抗原富集、緩釋、控釋等方面具有重要的應用價值。為獲得一種可用于注射的、在生理溫度附近具有良好相變可控性的溫敏型水凝膠，試驗分析了F127、F68、HPMC等不同組分對成膠行為的影響，通過測定并比較不同配方的凝膠溫度、凝膠時間等，篩選到6個符合最優成膠條件的溫敏型水凝膠配方，其在室溫下為無色透明液體，通針性良好，在溫度為37℃時可快速轉變為半固體凝膠態，成膠時間約3min。本試驗篩選出的溫敏型水凝膠配方為后續在疫苗佐劑方面的應用提供了基本試驗資料。

關鍵詞：溫敏型水凝膠;凝膠溫度;凝膠時間;泊洛沙姆

中圖分類號：S852.5文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0120-05

作者簡介：黃永娜（1994—），女，山東日照人，碩士，主要從事畜禽疫病防控方向的研究。E-mail：1271794375@qq.com。

通信作者：張金秋，副研究員，主要從事畜禽疫病防控研究。E-mail：jqzh03@126.com。

溫敏型水凝膠（temperaturesensitivehydrogel）是目前研究較為廣泛的原位水凝膠之一，能夠對外界環境溫度的變化作出及時響應，實現溶液—凝膠的相轉變，在生物醫藥、組織工程、細胞工程等方面具有重要應用價值[1]。特別是在藥物控釋方面，溫敏型水凝膠的三維網狀結構可以將藥物包裹在內，形成藥物儲庫，有助于提高藥物的載量。隨著凝膠在體內的降解或溶蝕，藥物緩慢釋放，可避免藥物的首過效應，延長藥物在體內的滯留時間，從而達到持續給藥的目的[2]。另外，一些蛋白類藥物進入機體后，很容易被酶類物質降解，使藥效得不到充分發揮，而利用溫敏型水凝膠作為蛋白類藥物的載體，可以顯著減緩蛋白類藥物的降解速度，借助緩釋作用提高藥物的生物利用度[3]。

溫敏型水凝膠的這一特征提示其可以作為優良的抗原載體，即可以用作疫苗佐劑，一方面有利于富集抗原，形成抗原儲庫，另一方面可以通過緩控釋功能，延長抗原在體內的存留時間，增加抗原與機體免疫系統的接觸，模擬疫苗多次免疫的效果，持續刺激機體產生高滴度的抗體。因此，本研究選擇生物相容性良好的高分子聚合物等作為凝膠基質，篩選不同物質的濃度及配伍比例，旨在制備一種適用于注射的溫敏型水凝膠，為后續的疫苗研發提供技術支持。

1材料與方法

1.1主要試劑

泊洛沙姆407（Poloxamer407，F127，SigmaAldrich公司）;泊洛沙姆188（Poloxamer188，F68，SigmaAldrich公司）;羥丙基甲基纖維素（HPMC，SigmaAldrich公司）;其他化學試劑均為分析純。

1.2主要儀器設備

數顯磁力攪拌器，江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司生產;HPX-9082MBE數顯電熱培養箱;超聲儀，上海聲浦超聲波設備廠生產;恒溫培養箱，德國Binder公司生產;DSC8500差示掃描量熱儀，美國PerkinElmer公司生產;流變儀MCR301，奧地利AntonPaar公司生產。

1.3配方的篩選

采用冷法制備溫敏型水凝膠[4]。準確稱量泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羥丙基甲基纖維素等高分子材料，溶于適量超純水中，于冰水浴條件下充分混合均勻，4℃冰箱過夜使其充分溶脹。

1.3.1F127對成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，HPMC的濃度為2.5%，調整F127∶HPMC的體積比分別為7∶1、6∶1、5∶2、4∶3、5∶1、4∶1、3∶1，觀察其成膠溫度的變化，考察F127的含量對凝膠行為的影響。

1.3.2F68對成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，HPMC的濃度為2.5%，F68的濃度為10%，調整F127∶F68∶HPMC的體積比分別為7∶1∶1、6∶1∶1、5∶1∶1、4∶1∶1，考察F68的含量對凝膠行為的影響。

1.3.3HPMC對成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，F68的濃度為10%，HPMC的濃度為2.5%，調整F127∶F68∶HPMC的體積比分別為7∶1∶0.5、7∶1∶1、6∶1∶0.5、6∶1∶1、5∶1∶0.5、5∶1∶1、4∶1∶0.5、4∶1∶1，考察HPMC的含量對凝膠行為的影響。

1.4凝膠時間的測定

采用倒置法，將配制好的溫敏性凝膠水溶液放置在培養箱中，自29℃開始升溫，控制升溫速度在1℃/2min，每隔2min倒置傾斜觀察，與水平面夾角成60°，以30s內液體不流動作為成膠判定依據，記錄膠凝溫度和膠凝時間。試驗重復3次，計算平均值。

1.5流變儀測定溫敏型水凝膠的玻璃化轉變溫度及黏彈性

按“1.3”節的方法制備樣品后，經流變儀MCR301測定樣品玻璃化轉變溫度（Tg）。設定應變值為10%，角頻率Ω為2rad/s，升溫范圍為10～50℃，升溫速度為2℃/min，10℃保溫2min，樣品測量厚度為0.5mm。觀察溫敏型水凝膠的儲模量G′和失模量G″隨溫度的模量變化情況，計算損耗因子tanδ的值。

2結果與分析

2.1溫敏型水凝膠的形態變化

從圖1可以看出，在室溫下該溫敏型水凝膠為具有良好流動性的無色透明液體，且流動性與溫度呈反向相關關系，即溫度越低，流動性越好，溫度為37℃時為不流動的半固體凝膠態。室溫下經1mL注射器注射試驗，該溫敏型水凝膠通針性良好。

[FK（W9][TPHYN1.tif][FK）]

2.2F127對成膠行為的影響

從表1可以看出，溫度升至39℃時，體積比為5∶2、4∶3、3∶1的體系仍不能成膠，對應F127的實際濃度為21.43%、17.14%、22.5%。由此篩選出可形成凝膠的試驗組別7∶1、6∶1、5∶1和4∶1，用于后續試驗。由F127：HPMC組成的體系中，F127的最低成膠濃度為24%，且F127的濃度越大，成膠溫度越低。

2.3F68對成膠行為的影響

在F127與HPMC體積比不變的情況下，僅改變F68的體積占比，考察成膠時間與成膠溫度的關系。從表2可以看出，提高F68的含量，體系的膠凝時間明顯增加。當F68的含量進一步增加，即F127∶F68∶HPMC的體積比為7∶3∶1.5、7∶4∶1.5時，體系在39℃以下均不能成膠。

2.4HPMC對成膠行為的影響

從表3可以看出，當固定F127與F68的比例時，增加HPMC的體積比能夠提高該溫敏型水凝膠的成膠溫度。同時，F127的含量越低，體系的成膠溫度越高，當F127∶F68∶HPMC的體積比為4∶1∶1時，即使溫度升至39℃，體系依然不能成膠。

2.5不同配方的凝膠時間比較

根據上述各因素對膠凝溫度和膠凝時間的影響，設計各種高分子物質的比例，比較不同凝膠配方在不同溫度的成膠時間。從表4可以看出，上述各組配方在36～38℃的成膠時間均在3min左右，且隨著配方中[KG*8]F127[KG*8]和[KG*8]HPMC[KG*8]含量的升高，相同溫度下體系的膠凝時間逐漸縮短。

2.6溫敏型水凝膠的玻璃化轉變溫度及黏彈性測定

以F127∶F68∶HPMC（體積比）=7∶1∶1.5的配方為例，通過流變儀測定該配方的玻璃化轉變溫度及黏彈性。從圖2-a可以看出，在10～25℃，樣品的儲能模量和損耗模量均無明顯變化。溫度繼續升高到25℃以上，儲能模量和損耗模量均開始明顯增加，但儲能模量<損耗模量，體系處于液態或黏性態;溫度升高至33℃時，儲能模量與損耗模量相當，體系由液態轉變為半固體凝膠態，此溫度即為該溫敏型水凝膠的玻璃化轉變溫度。當溫度繼續升高時，儲能模量>損耗模量，體系已完全轉變為固體凝膠態。該溫敏型水凝膠在狀態轉變的過程中模量變化范圍為0～2000Pa。損耗因子tanδ為損耗模量與儲能模量的比值，代表了體系的黏彈性。tanδ值越低，體系的黏彈性越大。從圖2-b可以看出，在體系處于流動態時，tanδ值較高;當體系成膠后，樣品的儲能模量大于損耗模量，tanδ值明顯下降，凝膠體系的黏彈性增大。

3討論與結論

溫敏型水凝膠良好的生物相容性和相轉變的可控性，使其成為醫藥領域研究的熱點。因制備溫敏型水凝膠的材料來源不同，凝膠的特性也具有很大差異。如殼聚糖、纖維素、透明質酸等天然物質制備的溫敏型水凝膠，生物相容度良好，已在藥物控釋、組織修復等方面有廣泛研究及應用。但殼聚糖溶解性較差，需要溶解在弱酸中，且殼聚糖的脫乙酰度對于體系能否成膠有重要影響[5]。研究表明，殼聚糖的脫乙酰度要達到85%以上，并加入一些物質，如β-甘油磷酸鈉等，對化學鍵進行改性或修飾，才可能形成凝膠體系。這些復雜的操作在很大程度上限制了殼聚糖溫敏型水凝膠的應用[6-7]。此外，透明質酸類溫敏型水凝膠的機械性能較差，凝膠強度不夠，易被酶解，通常需要進行物理或化學交聯，以改善凝膠性能。

聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物等高分子合成材料具有良好的水溶性、溫度敏感性及生物安全性，近年來已在黏膜給藥系統、經皮給藥系統中得以應用。本研究所選用的泊洛沙姆407（F127）、泊洛沙姆188（F68）均屬于聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，但聚氧乙烯和聚氧丙烯的比例不同。有文獻報道，F127的最佳成膠濃度范圍為18%～30%，濃度低于18%，溶液即使升至很高的溫度也不能成膠;濃度高于30%時，在室溫或更低溫度下就可能成膠，并且高濃度的水凝膠在制備過程中會更加困難[8]。因此單獨使用F127難以獲得在正常體溫范圍的可用于注射的溫敏型凝膠劑。F68單獨不能成膠，能在一定程度上起到消泡的作用，常用作穩定劑[9]。本試驗發現增加F68的含量，有助于提升F127體系的凝膠溫度，同時降低體系濃度。羥丙基甲基纖維素（HPMC）在口服藥物中常充當藥物賦型劑或輔料，在眼科用藥時常被作為潤滑劑[10]。HPMC本身的膠凝溫度較高，本研究將HPMC加入溫敏型水凝膠體系中，可以提高體系的成膠溫度，能避免體系在室溫下過快膠凝。同時，HPMC也可以作為懸浮劑，使體系更加均一穩定，增加生物黏附性[11]。

流變儀測定法是目前比較常用的衡量溫敏型水凝膠玻璃化轉變溫度的方法。通常情況下，儲能模量又稱為彈性模量，是指材料在發生形變時，由于彈性形變而儲存能量的大小，反映材料彈性大小;損耗模量又稱黏性模量，是指材料在發生形變時，由于黏性形變而損耗的能量大小，反映材料黏性大小。當儲能模量遠大于損耗模量時，材料主要發生彈性形變，所以材料呈固態;當損耗模量遠大于儲能模量時，材料主要發生黏性形變，所以材料呈液態;當儲能模量和損耗模量相當時，材料為半固態。本研究以F127∶F68∶HPMC（體積比）=7∶1∶1.5的配方為例，發現溫度約33℃時，體系的儲能模量與損耗模量相當，判斷在此溫度下，體系發生相轉變，呈凝膠態。另外，不同的材料表現出的狀態轉變也有很大差異[12-13]。如Supper等發現，殼聚糖水凝膠的黏彈性變化較為緩和，模量變化范圍在0～800Pa之間[14]。而本試驗所得的溫敏型水凝膠的模量變化范圍為0～2000Pa，表明泊洛沙姆及羥丙基甲基纖維素構成的凝膠體系強度更大，推測該類高分子聚合物材料形成的溫敏型水凝膠可能具有更致密的凝膠網絡結構或類固體性能。研究發現，應用其他輔料可以調節泊洛沙姆類溫敏型凝膠的膠凝溫度、膠凝時間及凝膠強度[15-16]。如添加甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或具有黏膜黏附性的聚卡泊菲等，能夠增加凝膠強度，減緩藥物釋放速率，這與本試驗中觀察到的現象相一致。

綜上所述，本研究以F127、F68、HPMC為基質，通過分析不同組分對成膠行為的影響，篩選出了在生理溫度附近（37℃左右）具有良好相變可控性的溫敏型水凝膠的配方。該溫敏型水凝膠在室溫下流動性良好，通針性佳，為后續進行免疫增強效果評價提供了技術支持。

參考文獻：

[1]湯玉峰，杜予民.殼聚糖基可注射型溫度敏感性水凝膠[J].化學進展，2008，20（2）：239-244.

[2]沈瑩.自微乳化胰島素經鼻給藥系統的研究[D].上海：上海醫藥工業研究院，2005.

[3]王欣欣.姜黃素微丸及囊泡的制備工藝和生物利用度研究[D].青島：青島科技大學，2017.

[4]劉玲秀，胡幗穎，劉欣，等.溫敏型可注射水凝膠的制備研究[J].中國生物醫學工程學報，2010，29（6）：901-908.

[5]WangQ，WangM，LiP，etal.TheinteractionofchitosanandBMP-2tunedbydeacetylationdegreeandpHvalue[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2019，107（4）：769-779.

[6]BaoZ，JiangC，WangZ，etal.Theinfluenceofsolventformulationsonthermosensitivehydroxybutylchitosanhydrogelasapotentialdeliverymatrixforcelltherapy[J].CarbohydratePolymers，2017，170：80-88.

[7]孫斌，劉洪臣.可注射溫敏殼聚糖/甘油磷酸鈉基水凝膠在醫學中應用進展[J].中華老年口腔醫學雜志，2011，9（1）：46-49.

[8]候冰娜，鄭澤鄰，趙梓年，等.可注射海藻酸鈉/泊洛沙姆復合水凝膠的制備及藥物緩釋研究[J].材料工程，2020（12）：60-67.

[9]DeyAK，BurkeB，SunY，etal.Useofapolyanioniccarbomer，Carbopol971P，incombinationwithMF59，improvesantibodyresponsestoHIV-1envelopeglycoprotein[J].Vaccine，2012，30（17）：2749-2759.

[10]MaheshB，KathyayaniD，NanjundaswamyGS，etal.Miscibility[JP4]studiesofplastic-mimeticpolypeptidewithhydroxypropylmethylcelluloseblendsandgenerationofnon-wovenfabrics[J].CarbohydratePolymers，2019，212：129-141.

[11]CostanzoS，PasquinoR，DonatoR，etal.Effectofpolymerconcentrationandthermalhistoryontheinversethermogelationofhydroxypropylcelluloseaqueoussolutions[J].Polymer，2017，132：157-163.[HJ1.98mm]

[12]Krezovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]BD，Miljkovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]MG，Stojanovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]ST，etal.Structural，thermal，mechanical，swelling，drugrelease，antibacterialandcytotoxicpropertiesofP（HEA/IA）/PVPsemi-IPNhydrogels[J].ChemicalEngineeringResearchandDesign，2017，121：368-380.

[13]Vukovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]JS，Babic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]MM，Anti[KG-*5]c[DD（-1*3][HT6]'[DD）]KM，etal.Invitrocytotoxicityassessmentofintelligentacrylatebasedhydrogelswithincorporatedcopperinwoundmanagement[J].MaterialsChemistryandPhysics，2016，175：158-163.

[14]SupperS，AntonN，SeidelN，etal.Rheologicalstudyofchitosan/polyol-phosphatesystems：influenceofthepolyolpartonthethermo-inducedgelationmechanism[J].Langmuir，2013，29（32）：10229-10237.

[15]HuangW，ZhangN，HuaH，etal.Preparation，pharmacokineticsandpharmacodynamicsofophthalmicthermosensitiveinsituhydrogelofbetaxololhydrochloride[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2016，83：107-113.

[16]KoffiAA，AgnelyF，PonchelG，etal.Modulationoftherheologicalandmucoadhesivepropertiesofthermosensitivepoloxamer-basedhydrogelsintendedfortherectaladministrationofquinine[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences，2006，27（4）：328-335.