原兒茶酸對刀豆蛋白A所致的免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、NO、SOD和GSH-PX表達的影響*

王麗惠，張佳祥，劉雙平，張惠勇，盧秋燕，沈培根

我國是肝病發生率較高的國家，肝病是全球范圍內引起死亡的重要原因之一[1]。肝損傷是肝病的主要表現，而引起肝損傷的因素也較多，免疫性肝損傷主要是外界異物進入體內，引起免疫細胞介導的免疫反應，導致肝組織大量炎性細胞浸潤，從而引起肝損傷[2，3]。原兒茶酸是一種天然的芬酸類物質，廣泛存在于蔬菜和水果中，也是很多中草藥的主要藥效成分[4]。研究表明，原兒茶酸除了具有抗血小板凝聚、降低心肌耗氧量等藥理作用外[5]，還具有很好的體外抗氧化活性，能夠抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡和1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)誘導的PC12細胞損傷[6，7]，表明其對神經損傷具有一定的保護作用，但尚未有原兒茶酸對免疫性肝損傷具有保護作用的相關研究報道。本研究采用刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)誘導小鼠免疫性肝損傷模型，探討了原兒茶酸抗肝損傷作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性昆明小鼠60只，體質量為19.37±1.24 g，購自湖北省實驗動物研究中心[生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018]，飼養在武漢大學中南醫院動物實驗中心[SYXK(鄂)2015-0025]。原兒茶酸(中國藥品生物制品鑒定所，批號：20140812)；刀豆球蛋白A(美國Sigma公司，批號：201608)；檢測白介素-4(IL-4)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；UV 1100紫外分光光度計(上海天美科學有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3型全波長多功能讀數儀(美國Thermo公司)。

1.2 免疫性肝損傷模型的制備 隨機將60只小鼠分為對照組、模型組、小、中、大(2.5 mg·kg-1·d-1、5 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1)原兒茶酸和(0.2 g·kg-1·d-1)聯苯雙酯處理組，在對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃處理，在藥物處理組分別給予不同劑量的藥物灌胃，連續10 d。在末次給藥1 h后，經尾靜脈注射ConA 35 mg.kg-1，誘導免疫性肝損傷小鼠模型。在造模8 h后，稱量體質量，摘眼球取血，采用脫頸法處死動物，剖取肝臟和脾臟，稱量并計算肝、脾臟質量指數(分別=肝、脾臟質量/體質量×100%)；對抽取的血液經3000 r/m離心10 min，分離血清，保存于-20℃待測；剪取小部分肝組織，于冰上研磨成肝組織勻漿，離心后取上清，保存于-20℃待測；另取部分肝組織，用10%甲醛固定，制成組織切片，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 各組小鼠臟器指數比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠肝和脾臟指數均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯苯雙酯處理后，肝、脾臟指數均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠臟器指數比較

2.2 各組小鼠血生化水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯苯雙酯處理后，血清ALT和AST水平均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血生化指標比較

2.3 各組小鼠血清炎性細胞因子水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯苯雙酯處理后，血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 各組小鼠血清細胞因子水平比較

2.4 各組小鼠肝組織勻漿MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠肝組織勻漿MDA和NO水平顯著升高，而SOD和GSH-PX活性顯著降低，不同劑量原兒茶酸和聯苯雙酯處理后，MDA和NO水平顯著降低，SOD和GSH-PX活性顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05，表4)。

表4 各組小鼠肝組織勻漿MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比較

2.5各組小鼠肝組織病理學表現 正常組小鼠肝小葉結構清晰，未見明顯損傷；模型組小鼠可見肝細胞腫脹，并伴有大量的炎細胞浸潤；不同劑量原兒茶酸和聯苯雙酯處理后，肝細胞腫脹程度顯著減輕，炎性細胞浸潤程度也明顯減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現(HE，400×)

3 討論

ConA誘導的肝損傷模型是目前篩選肝病治療的理想模型之一，其具有較好的肝臟特異性，并且造模過程簡單快速，能夠在一定程度上模擬人類病毒性肝病和自身免疫性肝病的病理學變化過程[8，9]。用不同劑量的ConA處理小鼠能引起肝損傷，并以壞死為主，并且模型較穩定[10]。因此，本研究選擇ConA建模[11]。本研究結果顯示，經ConA處理后，小鼠血清ALT和AST顯著升高，而經不同劑量的原兒茶酸處理后，血清上述指標水平顯著降低，表明原兒茶酸具有一定的肝損傷保護功能。

目前研究顯示，ConA導致的免疫性肝損傷模型均伴有各種免疫反應，而這些免疫反應有多種免疫細胞和炎癥因子的介導[12]。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的具有重要生物活性的細胞抑制劑，在機體免疫反應、炎癥反應、組織重構、細胞增殖和凋亡過程中均發揮著重要的作用[13]。有研究顯示，ConA誘導的免疫性肝損傷過程伴有TNF-α表達水平升高[14]。IL-4和IL-6均是免疫調節因子和炎癥介質，IL-4主要由活化的T細胞合成，能夠促進T細胞和B淋巴細胞分化并能激活Th2細胞為主的免疫應答[15]，而IL-6主要通過刺激細胞生長和胞外基質的增生，是引起肝臟炎癥的重要因素[16]。本研究結果顯示，模型組小鼠血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高，而不同劑量的原兒茶酸處理后，小鼠血清這些細胞因子水平顯著降低，表明原兒茶酸可能通過抑制炎癥細胞因子的合成和分泌，進而保護肝臟。

人體在生理和病理過程中均有氧自由基的形成，后者在機體正常的生化反應過程中充當著重要的中間體，但過量的氧自由基會引起組織的損傷和破壞，因此機體有一套完整的抗氧化酶防御自由基損傷系統[17]。SOD作為其中重要的一種內涵性金屬酶，能夠將超氧自由基歧化為過氧化氫，在GSH-PX的作用下繼續轉化為水，進而清除過量的氧自由基，而在免疫性肝損傷過程中，氧自由基大量生成，而SOD和GSH-PX等活性受到抑制，未被清除的氧自由基會攻擊細胞膜脂質，形成脂質過氧化的鏈式反應，MDA作為該過程的終產物，能夠間接反映機體受自由基攻擊的程度[18]。NO則作為一種活性介質，在肝損傷過程中發揮著雙重作用，既發揮著維持正常生理功能的作用，又參與病理性損傷過程[19]。本研究結果顯示，在ConA處理小鼠，肝組織勻漿MDA和NO水平顯著升高，而SOD和GSH-PX活性顯著降低，表明肝組織發揮了脂質過氧化反應，而MDA能夠嚴重地損傷肝細胞膜結構，引起細胞腫脹、壞死。經過不同劑量的原兒茶酸處理后，組織MDA和NO水平顯著降低，而SOD和GSH-PX活性顯著升高，可能是因為原兒茶酸本身就是一種抗氧化劑，能夠有效中和體內過量的氧自由基，解除對SOD和GSH-PX活性的抑制作用，從而減少對肝細胞脂膜的攻擊，進而保護了肝組織[20]。