四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織和HSC-T6細(xì)胞NOX4基因及其蛋白表達(dá)的變化*

彭 婕，李弼民，雷宇鵬

還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)是一類產(chǎn)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的功能酶，肝組織ROS主要來源于NOX4[1-3]。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，ROS可介導(dǎo)HSC活化和多種促纖維化因子的激活[4,5]。研究顯示， NOX1和NOX4的共同抑制劑GKT137831可減輕肝纖維化大鼠體內(nèi)ROS生成量和肝纖維化程度，提示NOX4可能參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程[6]。本研究觀察了不同肝組織NOX4水平情況，同時(shí)利用siRNA技術(shù)構(gòu)建了低表達(dá)NOX4的HSC-T6細(xì)胞，探討了NOX4對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖、凋亡和纖維化相關(guān)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，購自上海邦耀生物科技有限公司【動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滬)2019-0050】。鼠系肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞購自美國ATCC。CCl4(天津泰澤興業(yè)生物)，脂質(zhì)體2000試劑盒(美國Invitrogen)，基因序列和siRNA干擾序列(上海美軒生物)，抗NOX4、抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、抗I 型膠原(collagen I，Col1a I)、抗組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、抗金屬蛋白酶2(metalloproteinase -2，MMP-2)、抗轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、抗Smad2、抗p-Smad2、抗Smad3和抗p-Smad3蛋白(美國Cell Signaling)，DCFH-DA熒光探針和MTT粉末(上海恒斐生物)，Annexin V-FIFC/PI試劑盒(上海澤葉生物)。

1.2 肝纖維化動(dòng)物模型的制備 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只和模型組10只，分別給予等體積橄欖油或10% CCl4(CCl4:橄欖油體積比=1∶9)腹腔注射， 2次/w，注射6 w，構(gòu)建肝纖維化模型。在最后一次注射24 h后，處死動(dòng)物，迅速取出小鼠肝臟，部分固定于甲醛溶液中，制成組織切片，經(jīng)脫蠟、切片，常規(guī)行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察。將剩余的肝組織凍存于液氮罐中。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 正常培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，消化細(xì)胞、傳代。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，接種于6孔板，分為對(duì)照組、無意義對(duì)照組和NOX4-siRNA干預(yù)組。在后兩組，分別轉(zhuǎn)染無意義序列或NOX4-siRNA，構(gòu)建低表達(dá)NOX4的細(xì)胞株。

1.4 肝組織和細(xì)胞NOX4 mRNA水平檢測 用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，采用qRT-PCR法檢測NOX4 mRNA水平。NOX4上游引物序列為：CAGGAGG GCTG CTGAAGTATCAA，下游引物序列為：TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA；內(nèi)參GADPH上游引物序列為：ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG，下游引物序列為：GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA[7]。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min、94℃變性60 s、68℃退火60 s、72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算樣品NOX4 mRNA相對(duì)水平。

1.5 肝組織和細(xì)胞NOX4 表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測，采用RIPA法提取組織和細(xì)胞蛋白，檢測蛋白濃度后，取蛋白50～100 μg，行凝膠電泳分離，待標(biāo)記物移動(dòng)至底部前終止電泳。將凝膠切成適宜大小、轉(zhuǎn)膜，再行免疫反應(yīng)，最后進(jìn)行ECL顯影。采集蛋白條帶圖片，應(yīng)用Image J軟件行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算NOX4、α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞ROS含量檢測 將各組細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，用無糖培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，加入DCFH-DA熒光探針，繼續(xù)孵育30 min，于熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光量。

1.7 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法，取各組細(xì)胞1×105/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，分別加入含10%MTT的PBS緩沖液，繼續(xù)孵育4 h，再加入DMSO 150 μL，于570 nm處檢測各孔吸光度值(OD值)。

1.8 細(xì)胞周期和凋亡檢測 制備細(xì)胞懸液，經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗后，在70%乙醇中固定1 h，加入PI染液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀(美國BD)檢測細(xì)胞周期的變化；加入Annexin V避光下孵育細(xì)胞15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝組織NOX4 mRNA水平比較 與對(duì)照組比，模型組小鼠肝組織NOX4 mRNA和蛋白水平均顯著上升(P<0.05，圖1)。

圖1 兩組小鼠肝組織NOX4水平變化

2.2 三組HSC-T6細(xì)胞NOX4和ROS水平比較 NOX4-siRNA處理組NOX4 mRNA及其蛋白和ROS水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但對(duì)照組與無意對(duì)照組NOX4 mRNA及其蛋白和ROS水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 三組HSC-T6細(xì)胞NOX4和ROS水平比較

2.3 三組HSC-T6細(xì)胞增殖能力比較 NOX4-siRNA干預(yù)組細(xì)胞增殖活性和S期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，而G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組與無意組細(xì)胞增殖活性和各周期細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 三組HSC-T6細(xì)胞增殖能力比較

2.4 三組HSC-T6細(xì)胞凋亡水平比較 NOX4-siRNA處理組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但對(duì)照組與無意組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 三組HSC-T6細(xì)胞凋亡水平比較

2.5 三組HSC-T6細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 NOX4-siRNA處理組α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組與無意組上述蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖5 三組HSC-T6細(xì)胞纖維化相關(guān)分子表達(dá)水平比較

3 討論

在肝細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)，NOX能誘導(dǎo)ROS促進(jìn)HSC的活化，從而導(dǎo)致肝損傷及肝纖維化。同時(shí)，ROS水平上升也提高了機(jī)體氧化應(yīng)激水平，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[8]。另外，大量數(shù)據(jù)顯示，NOX4生成的ROS能間接損傷蛋白質(zhì)、DNA、類脂等物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[9,10]。研究指出， HSC胞內(nèi)NOX4呈高水平，且高于NOX家族其他酶類，提示NOX4可能具有特異性功能，參與HSC的激活過程[11]。因此，有人推測NOX4在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程有重要的作用，可能作為控制肝纖維化的新靶點(diǎn)。

本研究組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理學(xué)損傷，且沉積有大量膠原纖維，符合肝纖維化的病理學(xué)特征，提示肝纖維化模型制備成功。同時(shí)，肝組織NOX4水平的檢測結(jié)果顯示，肝纖維化組織NOX4 mRNA及其蛋白水平均升高，提示NOX4在肝纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中有重要的作用，與有關(guān)研究[12]結(jié)果相符。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化是可以逆轉(zhuǎn)的，而HSC的凋亡在逆轉(zhuǎn)過程中有重要作用[13]。在正常生理狀況下，HSC為靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)受到外界因素刺激后會(huì)激活HSC，生成大量的纖維組織成分，增加細(xì)胞外基質(zhì)。在肝纖維化恢復(fù)階段，HSC活化水平下降，且大量凋亡[14,15]。本研究結(jié)果顯示，沉默HSC-T6細(xì)胞NOX4表達(dá)，HSC-T6細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，大量細(xì)胞停滯于G0/G1期，且細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示下調(diào)NOX4能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，從而抑制肝纖維化發(fā)展。所以，可以反推因?yàn)镹OX活化，合成大量的ROS，能促進(jìn)HSCs的異常增殖，從而產(chǎn)生大量的膠原物質(zhì)并沉積，促進(jìn)肝纖維化的形成。

此外，在肝纖維化過程中有多種細(xì)胞、蛋白及其細(xì)胞因子的參與。α-SMA、Col1a I和TIMP-1是重要的促纖維化因子[16,17]。本研究顯示，下調(diào)NOX4的HSC-T6細(xì)胞α-SMA、Col1a I和TIMP-1水平顯著降低，提示NOX4可能調(diào)控上述促纖維化因子的生成，從而參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)，TGF-β /Smad通路在肝纖維化形成過程中有重要的調(diào)控作用，TGF-β1與細(xì)胞膜受體結(jié)合后活化，誘導(dǎo)Smad3等因子進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NOX4的HSC-T6細(xì)胞TGF-β1、Smad2 和Smad3 磷酸化水平顯著下降，表明HSC-T6細(xì)胞NOX4可以激活TGF-β /Smad信號(hào)通路，可能是NOX4參與肝纖維化的發(fā)生機(jī)制之一。