基于脂肪棕色化探究大黃素對老齡小鼠脂質代謝的影響

寧一博，程龍，黃芷棋，賀潤鋮，孫建寧，董世芬（北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 102488）

全球老齡化已成為不可逆轉的趨勢，預計2050年我國老齡人口數將達到5.25 億，占總人口數的32%，肥胖癥、高血壓、動脈粥樣硬化、2 型糖尿病等代謝性疾病的發生率隨之增加，老齡化及相關疾病的研究成為熱點[1]。研究顯示，機體代謝能力隨年齡增加有降低趨勢，有害脂質易產生沉積[2]。

目前發現哺乳動物體內存在3 種脂肪組織，分別為白色脂肪組織（WAT）、棕色脂肪組織（BAT）和米色脂肪組織。WAT 根據分布位置的不同又分為皮下WAT 和內臟WAT 等[3]。WAT 是儲能器官，主要由白色脂肪細胞構成，可將體內多余的能量以三酰甘油（TG）的形式儲存，而BAT 主要參與體溫調節和能量代謝，通過加快脂肪氧化來促進機體能量消耗[4]。米色脂肪組織通常存在于WAT 當中，但具有與棕色脂肪細胞類似的形態和功能[5]。脂肪組織不僅是儲能器官同時也是一種活躍的內分泌器官，可分泌瘦素（LEP）、脂聯素（ADPN）、抵抗素等脂肪因子，并參與全身能量代謝、脂質代謝[6]。衰老過程中脂肪組織發生重塑，白色脂肪堆積，褐變能力降低，并產生胰島素抵抗[7]。脂肪組織特異性功能障礙可誘發老年機體能量穩態失衡，并加劇衰老以及相關疾病如動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的進程[8-9]。

大黃素（emodin）是一種蒽醌類衍生物，是中藥大黃等的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫抑制等作用[10]，對結腸癌[11]、子宮內膜癌[12]、肝癌[13]等多種惡性腫瘤具有抑制作用。大黃素可降低高脂飲食小鼠體質量，降低血脂、肝臟膽固醇和三酰甘油（TG）水平[14]；體外研究顯示，大黃素可抑制3T3-L1 前脂肪細胞增殖及分化，減少脂質蓄積[15]。本研究基于脂肪棕色化探究大黃素對老齡小鼠脂質代謝的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

40 只10月齡SPF 級C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，體質量（30±2）g [北京華阜康生物技術有限公司，SCXK（京）2014-0004]。10 只8 周齡SPF級C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g[斯貝福（北京）生物技術有限公司，SCXK（京）2016-0002]。所有小鼠飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室[許可證號SYXK（京）2016-0038，且均通過北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審批]。

1.2 試藥

大黃素（批號：T02S8F42983）、羅格列酮（批號：Y05F9C54480）（上海源葉生物科技有限公司）；總膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ADPN、LEP 的ELISA 試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；游離脂肪酸（FFA）ELISA 試劑盒（江蘇科特生物技術有限公司，批號：201812）；解偶聯蛋白-1（UCP1)一 抗（英國Abcam 公司，批號：GR3188478-6）；HRP 山羊抗兔（批號：GB23303）、檸檬酸抗原修復液（批號：G1202）、蘇木素染液（批號：G1004）、DAB 顯色液（批號：G1211）、蘇木素分化液（批號：G1039）（武漢塞維爾生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅染液（武漢谷歌生物科技，批號：G1005）。

1.3 儀器

JB-L5 冷凍臺、JB-P5 包埋機、JJ-12J 脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；S/N601-0723 全波長酶標儀（江蘇萬科科教儀器有限公司）；DHG-9140A烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；NIKON ECLIPSE CI 顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 實驗動物分組、造模及給藥

40 只10月齡SPF 級雌雄各半C57BL/6J 小鼠普通飼料喂養8 周后，將其隨機分為老齡組、大黃素40 mg·kg－1組、大黃素80 mg·kg－1組和羅格列酮10 mg·kg－1組，每組10 只。另設10 只雌雄各半8周齡SPF 級C57BL/6J 小鼠為非老齡組。老齡組和非老齡組小鼠每日給予相同溶媒（飲用水）灌胃。大黃素組小鼠分別按照40 mg·kg－1、80 mg·kg－1，羅格列酮組小鼠按照10 mg·kg－1劑量灌胃給藥，灌胃容積0.1 mL/10 g，連續灌胃給藥6 周。

2.2 取材

末次給藥后，動物禁食12 h，麻醉，摘眼球取血，3500 r·min－1離心10 min，分離血清。并分離小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織（iWAT）以及肩胛處BAT，固定在10% 中性福爾馬林固定液中。

2.3 脂肪組織質量與體質量比值的測定

精確稱取小鼠皮下iWAT 以及肩胛處BAT 質量，計算iWAT 與體質量，肩胛處BAT 質量與體質量的比值。

2.4 血脂相關指標檢測

按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、LEP、ADPN 和FFA 的含量。

2.5 HE 染色觀察脂肪細胞形態變化

將固定在10%中性福爾馬林固定液中的iWAT、BAT 取出依次進行常規脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.6 免疫組化檢測脂肪組織UCP1 表達

石蠟切片進行常規脫蠟，將iWAT、BAT 切片放在抗原修復緩沖液中進行修復，在iWAT、BAT 切片上滴加3%雙氧水溶液，避光室溫孵育25 min，0.01 mol·L－1PBS 洗3 次，在切片上滴加山羊血清封閉1 h。在切片上滴加稀釋好的一抗溶液（1∶500），將切片放入濕盒內4 ℃過夜。滴加稀釋好的二抗，37℃孵育20 min，DAB 顯色，蘇木素復染3 min，常規脫水，中性樹膠封片。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件，選取棕黃色處為陽性著色，對陽性表達處進行AOD 分析，計算脂肪組織UCP1 蛋白原位表達。

2.7 統計學處理

統計學處理采用SAS8.2 軟件進行，實驗數據以平均值±標準差（±s）表示，對于正態數據，多組間比較采用單因素方差分析法（ANOVA），兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大黃素對老齡小鼠體質量的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠體質量顯著升高（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1組給藥后體質量無明顯變化（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 大黃素對老齡小鼠體質量的影響（±s，n ＝10）Fig 1 Effect of emodin on body mass of aging mice（±s，n ＝10）

3.2 大黃素對老齡小鼠脂肪比重的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠肩胛處BAT 質量與體質量比值有降低趨勢（P＞0.05），皮下iWAT 質量與體質量比值升高（P＜0.01）；大黃素及羅格列酮干預對小鼠皮下脂肪比重未見顯著影響（P＞0.05）（見圖2）。

圖2 大黃素對老齡小鼠脂肪質量與體質量比值的影響（±s，n＝10）Fig 2 Effect of emodin on the ratio of BAT and iWAT to body weight in aging mice（±s，n ＝10）

3.3 大黃素對老齡小鼠血脂相關指標的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠血清中TC、TG和FFA 含量顯著升高（P＜0.01）；與老齡組小鼠比較，大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1組小鼠血清中TC、TG 含量分別降低40%、39%和41%、33%（P＜0.01）；大黃素40 mg·kg－1組血清中FFA 含量降低18%（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 大黃素對老齡小鼠血清中血脂相關指標的影響（±s，n ＝10）Fig 3 Effect of emodin on blood lipids in aging mice（±s，n ＝10）

3.4 大黃素對老齡小鼠脂肪因子的影響

與非老齡組比較，老齡組小鼠血清中LEP 含量顯著升高（P＜0.05），大黃素對老齡動物血清LEP 水平未見顯著影響。與非老齡組比較，老齡組小鼠血清ADPN 水平顯著降低（P＜0.05），大黃素40 mg·kg－1和80 mg·kg－1可顯著升高老齡動物血清ADPN 水平，分別升高33%和44%（P＜0.05）（見圖4）。

3.5 老齡小鼠BAT 及iWAT 的HE 染色結果

圖4 大黃素對老齡小鼠血清中LEP 及ADPN 的影響（±s，n ＝10）Fig 4 Effect of emodin on LEP and ADPN in the serum of aging mice（±s，n ＝10）

HE 染色結果顯示，與非老齡組比較，老齡組小鼠BAT 細胞直徑較大，細胞白色化趨勢顯著；與老齡組小鼠相比，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組小鼠BAT 較為緊密，細胞變小，細胞核明顯，細胞間具有豐富的毛細血管。在iWAT 中，與非老齡組比較，老齡組小鼠脂肪組織較為松散，脂肪細胞直徑較大，白色脂肪特征明顯；與老齡組相比，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組小鼠皮下白色脂肪細胞變小，棕色化趨勢顯著（見圖5）。

3.6 大黃素對老齡小鼠BAT、iWAT 部位UCP1蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與非老齡組比較，老齡組小鼠BAT 中UCP1 陽性細胞表達顯著減少（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組UCP1 陽性細胞表達明顯增多（P＜0.01）。在iWAT 中，老齡組UCP1 陽性細胞表達明顯減少（P＜0.01）；與老齡組比較，大黃素40、80 mg·kg－1組及羅格列酮10 mg·kg－1組UCP1 陽性細胞表達明顯增多（P＜0.05 或P＜0.01）（見圖6）。

4 討論

老年機體常伴隨脂質代謝的異常，表現為脂質異位沉積、血液黏稠度增加等，高脂血癥是肥胖癥、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等疾病的重要易感因素[16]。脂肪組織在維持全身脂質穩態中具有重要作用，脂肪組織以TG 的形式存儲能量，當機體需要能量時，TG 分解為FFA 和甘油提供能量[17]。WAT 脂解產生的脂肪酸可在肝臟內合成極低密度脂蛋白（VLDL），VLDL 進入循環后轉變為LDL，LDL 是誘發動脈粥樣硬化的因素之一[18]。過量的血清脂肪酸可能會誘發炎癥反應，從而導致胰島素抵抗[19]。此外，脂肪細胞大小是血脂和胰島素穩態變化的重要預測因子，其變化可增加患心血管疾病的風險[20]。

本實驗中，與非老齡組比較，老齡組小鼠血清TC、TG、FFA 含量顯著增加，同時可以觀察到皮下白色脂肪細胞更加肥大，棕色脂肪細胞“白色化”更加明顯。與老齡組比較，大黃素40 mg·kg－1、80 mg·kg－1組小鼠血清TC、TG 含量顯著下降，大黃素40 mg·kg－1組小鼠血清FFA 含量顯著降低。此外，大黃素干預組小鼠血清中脂肪因子ADPN 水平明顯升高。ADPN 主要由脂肪細胞分泌，具有增加胰島素敏感性并直接改善脂肪組織脂質代謝的作用[21]。LEP 主要由皮下脂肪細胞分泌，可作用于神經及免疫系統，具有降低體質量、調節能量代謝和促進WAT 褐變的作用[22-23]。LEP 水平與脂肪組織質量具有相關性，老年機體白色脂肪堆積導致LEP 水平升高，持續高水平的LEP 導致其利用率降低進而產生LEP 抵抗[24]。本研究結果顯示老齡動物血清LEP 水平升高，大黃素對LEP 未見明顯調節作用。

BAT 是高度血管化和神經支配的組織，在嚙齒類動物中主要存在于肩胛處、腎周圍和主動脈周區，棕色脂肪細胞具有多室脂滴和大量的線粒體以及豐富的交感神經和毛細血管[25]。UCP1 是位于棕色脂肪細胞線粒體內膜上的蛋白，是BAT產熱的必需蛋白[26]。UCP1 可破壞線粒體內膜兩側的H＋濃度，使氧化與磷酸化解偶聯，能量以熱能的形式釋放[27]。BAT 可加快脂肪的氧化產熱，增加機體的能量代謝，從而消除脂肪組織功能障礙[28]。BAT 可吸收血液中富含TG 的脂蛋白釋放的脂肪酸，儲存在細胞內，作為H＋的同向轉運體激活UCP1 促進產熱，同時降低血清TG水平并增加肝臟VLDL 殘留清除率[28]。在β-腎上腺素能受體激動劑或冷暴露下，原本具有白色脂肪細胞特征的脂肪細胞脂滴逐漸增多、線粒體數量增加、UCP1 大量表達、產熱增加，表現出棕色脂肪細胞樣形態及功能，這個過程稱為“白色脂肪棕色化”[29]，目前WAT 褐變成為改善相關代謝疾病的潛在靶標。本實驗中HE 染色結果顯示，與老齡組相比，大黃素40 mg·kg－1、80 mg·kg－1組小鼠白色脂肪細胞出現多室，細胞變小變圓細胞更加致密，具有明顯的“褐變”趨勢，同時棕色脂肪細胞分布明顯增多，細胞間毛細血管更加豐富，大黃素可顯著增加iWAT 及BAT 中UCP1 的表達。

綜上，老齡小鼠可出現脂質代謝紊亂，WAT比重增加，脂肪呈現白色化趨勢；大黃素可改善老齡動物的脂質代謝紊亂，作用可能與抑制白色脂肪，減少周圍脂質釋放，促進脂肪棕色化，改善能量代謝有關。

圖5 大黃素對老齡小鼠脂肪組織形態的影響（HE 染色，×400）Fig 5 Effect of emodin on the morphology of adipose tissue in aging mice（HE staining，×400）

圖6 大黃素對老齡小鼠脂肪組織UCP1 蛋白表達的影響（±s，n ＝10）Fig 6 Effect of emodin on the expression of UCP1 protein in adipose tissue of aging mice（±s，n ＝10）