基于HT-29細胞的枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝研究

羅曦，李天嬌，2，3，包永睿，2，3，王帥，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，歸脾、胃經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，最早記載于南北朝《雷公炮炙論》[2]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類和生物堿類等化學成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[4]。結(jié)腸癌是消化道腫瘤中常見的惡性腫瘤，中醫(yī)理論認為，“邪之所湊，其氣必虛”，脾胃虛弱是結(jié)腸癌的病理基礎，西醫(yī)治療方法手術(shù)和化療可能會進一步損傷脾胃功能，故中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌以健脾理氣為主要方法[5]。據(jù)文獻報道，中醫(yī)臨床治療結(jié)腸癌的處方中經(jīng)常出現(xiàn)理氣藥枳殼[6-8]，但其抗結(jié)腸腫瘤方面的相關研究較少。本實驗基于人結(jié)腸癌細胞HT-29 體外藥效實驗，通過正交實驗設計，以HT-29 細胞抑制率為指標，對枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分的提取工藝進行篩選，并結(jié)合層次分析法，優(yōu)選可代替藥效指標綜合評分的權(quán)重系數(shù)，以期為枳殼合理利用、藥效物質(zhì)基礎及作用機制研究提供前期基礎。

1 材料

1.1 儀器與試藥

UV-1750 型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；HSS 型電子恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；YJ-200A 型高速中藥粉碎機（億健品牌）；JE1002 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；Mettler Toledo ME55 分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國NUAIRE 公司）；倒置顯微鏡（德國麥克奧迪公司）；酶標儀（美國Molecular Drvices 公司）；枳殼藥材（亳州市康美中藥有限公司，批號：20200716，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學許亮教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實）；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：100080-201418，供含量測定用）；無水乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；胎牛血清、McCoy’s 5A 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國GIBCO 公司）；青霉素/鏈霉素溶液、CCK-8 增強型溶液（Meilunbio 公司）。

1.2 細胞瘤株

人結(jié)腸癌細胞HT-29（中國科學院上海生命科學研究院細胞庫）。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳殼黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，用無水乙醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度為0.15 mg·mL－1的對照品溶液，備用。

2.1.2 檢測波長的選擇 采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法[9]，精密吸取蘆丁對照品溶液2 mL置于10 mL 量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，振搖后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，加30%乙醇至刻度，混合搖勻，靜置15 min。不加蘆丁對照品按照以上方法制備空白對照，在400 ～750 nm 波長下進行掃描，結(jié)果對照品溶液在510 nm 處有最大吸收，故確定510 nm 為檢測波長。

2.1.3 標準曲線的建立 精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 蘆丁對照品溶液，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，振搖后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4% 氫氧化鈉溶液2 mL，加30% 乙醇至刻度，混合搖勻，靜置15 min。在 510 nm 波長處測定吸光度，以蘆丁含量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.0011X－0.0069（r＝0.9996）。結(jié)果顯示，蘆丁在 0 ～600 μg·mL－1內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2 HT-29 細胞培養(yǎng)及抑制率檢測

2.2.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞HT-29，按貼壁細胞培養(yǎng)方法，接種于含體積分數(shù)為10%胎牛血清、1% 雙抗的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基中，在溫度為 37 ℃、5% CO2、濕度為70%～80%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代，取對數(shù)生長期細胞做后續(xù)實驗。

2.2.2 CCK-8 法檢測細胞抑制率 取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細胞HT-29，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化，以 7500 cell /孔的密度接種于96 孔板，設調(diào)零孔、空白孔和加藥實驗孔。于37℃、5% CO2、濕度為70%～80% 的條件培養(yǎng)24 h 后，加藥實驗組加入樣品溶液100 μL，空白對照組加入等體積培養(yǎng)液（每組5 個復孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法，用酶標儀在450 nm 處掃描，測定吸光度（OD）。計算藥物對細胞的增殖抑制率，細胞抑制率＝（1－實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.3 枳殼黃酮提取工藝考察

2.3.1 乙醇濃度單因素考察 對水、30%、50%、75%、95% 乙醇進行考察，結(jié)果黃酮含量分別為3.42%、4.01%、4.99%、5.39%、5.02%。表明75%乙醇對枳殼黃酮類成分的提取率最高，因此選用75%乙醇作為最佳提取溶劑。

2.3.2 正交設計 根據(jù)預實驗及參考文獻[10]，取枳殼適量，60℃下烘干后粉碎，精密稱取9 份過40目的枳殼藥材粉末，每份5 g，采用75%乙醇為提取溶劑進行提取，選擇溶劑用量（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）作為影響因素，每個因素取3個水平，進行L9（34）正交實驗。因素水平見表1。精密稱取9 組正交實驗獲得的提取物粉末，配制成0.01 g（生藥）·mL－1濃度的含藥培養(yǎng)液，作用于HT-29 細胞，以細胞抑制率為指標，優(yōu)選提取工藝，正交結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factor and level

表2 正交設計直觀分析Tab 2 Orthogonal design visual analysis

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

以人結(jié)腸癌HT-29 細胞抑制率為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為A ＞B ＞C，其中溶劑用量（A）、提取時間（B）對細胞抑制率影響較大（P＜0.05），為主要因素；提取溫度（C）影響較小。由于提取時間（B）也是影響提取工藝的主要因素，故為驗證優(yōu)選提取時間的準確性，在其他提取條件均為最優(yōu)時，對其進行單因素考察。分別對2、2.5、3 h 進行單因素考察，發(fā)現(xiàn)細胞抑制率分別為 77.04%、79.17%、79.51%，為提高生產(chǎn)效率，確定提取時間為2.5 h。綜上所述，結(jié)合抑制率結(jié)果篩選出最佳提取條件為A2B2C2，即25 倍量75%乙醇，在75℃下提取2.5 h。

2.4 層次分析法對黃酮含量和出膏率權(quán)重系數(shù)的確定

以黃酮含量和出膏率為指標，評價枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分的提取工藝，建立評價目標模型，結(jié)果見圖1。

圖1 枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝評價模型Fig 1 Evaluation model of extraction process of effective components from Fructus aurantii for colon tumor

通過比較同一層次目標（黃酮含量和出膏率）的相對重要程度，構(gòu)成一系列兩兩比較矩陣。利用Analytic Hierarchy Process（AHP）軟件，計算權(quán)重系數(shù)隨機一致性比率CR（CR＝CI/RI），其可作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標，得到9 組CR＝0.0000 ＜0.1，即認為矩陣具有滿意的一致性，表明9 組權(quán)重系數(shù)合理有效，可用于提取工藝優(yōu)選的綜合評分中，見表4。

表4 兩種指標在不同重要程度下的權(quán)重系數(shù)Tab 4 Weight coefficient of two indexes in diffrent importance degree

按照各指標不同的權(quán)重系數(shù)來計算綜合評分，作為提取工藝的評價指標，以“比較重要”為例，實驗設計和結(jié)果見表5 和表6 [綜合評分1 ＝（黃酮含量/最大黃酮含量）×0.8333 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.1667；綜合評分2 ＝（黃酮含量/最大黃酮含量）×0.1667 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.8333]。

以綜合評分1 為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為A ＞B ＞C，其中溶劑用量（A）影響最大（P＜0.05），為主要影響因素。提取時間（B）和提取溫度（C）無顯著影響，而且 B2 和B3，C2 和C3 結(jié)果相差不大，從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約能源角度考慮，確定提取時間為2.5 h，提取溫度為75℃。

表5 正交實驗設計及直觀分析結(jié)果Tab 5 Orthogonal experiment design and visual analysis

表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance

以綜合評分2 為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為 C ＞A ＞B，其中提取溫度（C）影響最大（P＜0.05），溶劑用量（A）和提取時間（B）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約溶劑角度考慮，優(yōu)選出的工藝條件為A1B1C3，即20 倍量75%乙醇，在80℃下提取2 h。

當黃酮含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.8333、0.1667 時，以綜合評分1 與細胞抑制率為指標優(yōu)選的最佳提取條件一致，說明在此權(quán)重系數(shù)下，兩者的綜合評分可代替細胞抑制率，作為枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的考察指標。當權(quán)重系數(shù)為0.1667、0.8333 時，以綜合評分2 為指標優(yōu)選的最佳提取條件與以細胞抑制率為指標優(yōu)選出的提取工藝不一致。

同時，對其他權(quán)重系數(shù)計算綜合評分，進行正交實驗直觀分析和方差分析，得到黃酮含量和出膏率最佳的權(quán)重系數(shù)范圍分別為0.75 ～0.90、0.10 ～0.25。在此權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，其綜合評分可代替細胞抑制率，作為提取工藝的考察指標。

2.5 驗證實驗

平行稱取3 份等量藥材，按照優(yōu)選出的最佳提取工藝，即25 倍量 75% 乙醇，在75℃水浴條件下，回流提取 2.5 h，進行提取。黃酮含量分別為6.106%、6.127%、6.149%，出膏率分別為25.92%、25.99%、25.86%，細胞抑制率分別為73.92%、74.08%、74.15%，3 項指標的RSD分別為0.35%、0.25%、0.18%，說明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行，且體外藥效穩(wěn)定。選取2 個權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)外的數(shù)值，對其綜合評分與細胞抑制率進行Pearson 相關性分析[11-14]，確定權(quán)重系數(shù)范圍的準確性和合理性，結(jié)果見表7。

表7 權(quán)重系數(shù)范圍驗證結(jié)果Tab 7 Validation of weight coefficient range

根據(jù)前面得出的黃酮含量和出膏率最佳的權(quán)重系數(shù)范圍，通過Pearson 相關性分析可知，在確定的權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)（組別1），綜合評分與細胞抑制率的相關系數(shù)較大；在權(quán)重系數(shù)范圍外（組別2），相關系數(shù)較小，說明黃酮含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)范圍合理。

3 討論

枳殼為健脾理氣、寬腸行滯的常用藥，同時具有抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等藥理作用，常被加入“健脾理氣法”治療結(jié)腸癌的中藥處方中使用。目前尚無其在抗結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝方面的報道，因此本實驗對其進行研究，為開發(fā)以枳殼為原料的抗腫瘤新藥提供實驗依據(jù)和理論基礎。

中藥化學成分復雜，且各化學物質(zhì)組之間相互影響，因此藥效物質(zhì)組的含量與藥效之間不呈線性相關。若單以藥效物質(zhì)組分的含量為提取工藝的考察指標，不能保證所選提取工藝的提取物達到最佳藥效；若單以細胞抑制率結(jié)果為評價指標，雖能保證藥效，但操作繁瑣費時。因此，本實驗針對中藥化學成分的特點，運用層次分析法[15-18]，將枳殼治療結(jié)腸腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的評價指標構(gòu)成單層次、兩指標體系，在主觀判斷的基礎上進一步處理，使其在權(quán)重系數(shù)的賦予上更加科學、合理，同時建立黃酮含量、出膏率與藥效的關聯(lián)，即通過細胞抑制率結(jié)果為指標的正交實驗結(jié)果，篩選出代替細胞抑制率的黃酮含量和出膏率綜合指標的權(quán)重系數(shù)及其范圍。本實驗篩選出了影響提取工藝的主要和次要因素，避免了賦予權(quán)重系數(shù)的偶然性，不但能確保提取物的藥效，且避免了復雜的操作，使工藝更加合理可行。通過Pearson 相關性分析可知，在權(quán)重系數(shù)范圍內(nèi)，其綜合評分可代替藥效指標，作為其抗腫瘤藥效物質(zhì)組分提取工藝的評價指標。

本實驗以綜合評價指標代替藥效，對枳殼治療結(jié)腸腫瘤的藥效物質(zhì)組分提取工藝進行研究可為其合理開發(fā)和利用奠定基礎，為其治療結(jié)腸腫瘤的藥效物質(zhì)基礎及作用機制研究提供理論依據(jù)。