齊墩果酸通過調控IL-6/STAT3信號通路影響結腸癌細胞的增殖和凋亡

桂孟玹，黃彬，王瑞國，林久茂*（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 3501；.福建中醫藥大學藥學院，福州 3501；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福州 3501；4.中西醫結合基礎福建省高等學校重點實驗室（福建中醫藥大學），福州 3501）

結直腸癌（CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率越來越高，目前已成為世界第三大高發癌癥[1]。CRC 的發生和炎癥密切相關，促炎細胞因子的過度分泌可以促進腫瘤的發展和轉移[2-3]。近年來研究表明，白介素 6 （interlenkin-6，IL-6）及其受體的信號通路參與了CRC 的發生、發 展[4-5]。IL-6 與IL-6 受 體（IL-6R）的 結合會啟動細胞內信號傳導級聯反應，從而激活轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）增強局部炎癥環境，STAT3 持續的激活會引起腫瘤細胞的增殖、凋亡失衡，進一步促進腫瘤進展[6]。

當前CRC 的治療主要通過手術切除并配合化療藥物以提高生存率，并降低術后的腫瘤復發和轉移，但由于化療藥物對正常細胞亦具有殺傷作用，容易引起嚴重的毒副反應，導致患者的生存質量下降[7-8]。目前，已有研究報道使用中草藥輔助抗腫瘤，并取得了不錯的效果[9-10]。白花蛇舌草是目前已有應用于輔助治療CRC 的中草藥，其主要藥效成分齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是一種五環三萜類化合物，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、護腎、保肝等作用[11-14]。近年來，基于具有明確藥效的中草藥，從其中發掘中草藥藥效活性成分并開發成單體藥物是當前中西醫結合臨床治療重大疾病的熱點。有研究表明，OA 對多種惡性腫瘤細胞具有抑制增殖的作用，但其藥效功能研究尚未完全闡明，藥效作用機制有待進一步明確[15]。因此，本研究以人結腸癌HT-29 細胞為對象，評價OA 對HT-29 細胞的增殖和凋亡的影響，并通過研究OA 對IL-6/STAT3 信號通路的調控作用，為該化合物防治結腸癌提供理論研究基礎。

1 材料

1.1 試藥

齊墩果酸（OA，批號：O5504）、白介素 6（IL-6，批號：I1395）（美國Sigma 公司）；人結腸癌HT-29 細胞（中國科學院細胞庫）。DMEM 培養基（批號：SH30022.01）、胎牛血清（FBS，批號：10099-141）、青霉素-鏈霉素（批號：15070063）、胰蛋白酶-EDTA（批號：25200-056）、TRIzol 試劑（批號：12183555）、Caspase-3 活力試劑盒（批號：037-100）（美國Invitgen 公司）；抗Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15、p-STAT3、STAT3、β-actin 單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗（Cell Signal Technology 公司，批號分別為：15071、89477、55506、12790、36303、9145、9139、3700、7074）。BCA 蛋白檢測試劑盒（批號：kgabca）、DAPI 染色試劑盒（批號：kga215）（南京凱基生物科技有限公司）。

1.2 儀器

酶標儀（Infinite M200， TECAN，瑞士）， 倒置顯微鏡（Leica DMIL LED，Solms，德國），熒光顯微鏡（Leica DMI4000B，Solms， 德國）， 凝膠分析系統（Model Gel Doc 2000，Bio-Rad Laboratory，美國）。

2 方法

2.1 細胞培養

細胞在含有10%FBS、100 U·mL－1青霉素和100 μg·mL－1鏈霉素的DMEM 培養基中，37°C，5%CO2環境下培養，以貼壁單層形式生長。

2.2 實驗分組設置

實驗設置空白對照組、IL-6（10 ng·mL－1）處理組和不同濃度OA（40、80、120 μmol·L－1）＋IL-6（10 ng·mL－1）組。

2.3 MTT 法檢測細胞增殖情況

當細胞密度達到70%～80%后，使用胰酶消化細胞，在3000 r·min—1，離心5 min 后，棄去上清，用DMEM 完全培養基重新懸浮，并稀釋成1×105個·mL－1。以100 μL 每孔接種到96孔板中，在37°C 孵育24 h 后，按照分組加入OA和/或IL-6 處理24 h，然后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg·mL－1），繼續孵育4 h，加入100 μL 二甲基亞砜溶解紫色甲瓚晶體。用酶標儀于570 nm處檢測吸光度（A）值，計算細胞活力。細胞活力（%）＝實驗組A值/對照組A值×100%。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞密度變化

HT-29 細胞以2.5×105個·mL－1的密度，每孔2 mL 的體積接種于6 孔板中。按照分組加入OA 和/或IL-6 處理細胞24 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態，觀察細胞密度變化。

2.5 DAPI 染色和Annexin V/PI 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將HT-29 細胞以1×105個·mL－1的密度接種于12 孔培養板中，每孔1 mL 細胞懸液，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理細胞24 h 后，用無菌PBS 洗滌細胞，4%多聚甲醛固定10 min，室溫下用DAPI（4 μg·mL－1）染色10 min，再用無菌PBS 清洗，在熒光顯微鏡下觀察。

為了驗證OA 是否可以誘導HT-29 細胞凋亡，將2.5×105個·mL－1的HT-29 細胞 以2 mL 的 細胞懸液體積接種于6 孔板中，按上述方法同樣處理HT-29細胞后，根據廠家說明書，采用FACSCalibur細胞分析儀（BD Biosciences）和Annexin V-/PI 試劑盒進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 Caspase-3 活力測定

根據Caspase-3 活力測定試劑盒說明書，通過比色分析來測定Caspase-3 的活性。按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細胞24 h 后，用試劑盒提供的裂解緩沖液在冰上裂解HT-29 細胞30 min。裂解細胞在16 000×g 下離心10 min，用BCA 法測定上清液中的蛋白質濃度。隨后，將100 μg 蛋白與50 μL Caspase-3 的特定底物在37°C 的避光條件下孵育2 h，使用酶標儀在405 nm 波長處測定吸光度，計算Caspase-3 活力。

2.7 細胞周期分析

將2 mL 的2.5×105個·mL－1HT-29 細 胞接種于6 孔板中，按照分組加入OA 和/或IL-6處理HT-29 細胞24 h 后，收集細胞，并調整細胞濃度至2×105個·mL－1，碘化丙啶（PI）細胞周期分析試劑盒染色后，用熒光激活細胞分選法檢測細胞周期進程。將細胞置于70%乙醇中，于4℃條件下固定過夜，然后用預冷的PBS 洗滌兩次，再用核糖核酸酶（8 μg·mL－1）和磷脂酰肌醇（10 μg·mL－1）孵育30 min。通過流式細胞儀的FL1 通道檢測熒光信號，并使用ModFit LT 軟 件（版 本3.0；Verity Software House，Inc.，Topsham，ME，USA）分析細胞周期各時相中DNA 的比例。

2.8 集落形成實驗

將處于指數生長期培養的HT-29 細胞以1×105個·mL－1的密度接種到12 孔培養板中，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細胞24 h，隨后收集細胞以1×103個·mL－1，每孔2 mL的細胞懸液接種到6 孔板中。在37°C、5%CO2的細胞培養箱中孵育8 d 后，將形成的細胞集落固定在4%多聚甲醛中10 min，結晶紫染色計數。

2.9 Western blot 分析

將2×105個·mL－1的HT-29 細胞接種于25 cm2培養瓶中，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細胞24 h 后，收集細胞樣本，用含有不同蛋白抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解細胞，用BCA 法測定總蛋白濃度，從每個細胞裂解液中提取等量的蛋白質，經SDS-PAGE 電泳后轉移到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，并與相應的抗STAT3、p-stat3、CyclinD1、CDK4、Bcl2、BAX 或β-actin（稀釋倍數，1∶1000）一抗在4°C 下孵育過夜，用適當的辣根過氧化物酶偶聯二抗結合ECL 化學發光試劑，對不同指標進行檢測，并做圖像分析。

2.10 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析

將2×105個HT-29 細胞接種于含有2 mL 完全DMEM 培養基的6 孔板中，按照分組加入OA和/或IL-6 處理HT-29 細胞24 h 后，用TRIzol 試劑提取總RNA，用SuperScript 反轉錄酶（Promega Corporation）反轉錄1 μg 的RNA。PCR 法檢測Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15 mRNA 的表達，以GAPDH 作為內參。通過凝膠電泳（1.5%瓊脂糖凝膠）分析樣品，并使用凝膠分析系統分析DNA條帶。

2.11 統計學分析

數據采用SPSS 24.0 統計軟件進行處理。結果用±s表示；先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件者，兩組比較采用t檢驗；未滿足條件者，兩組比較用 Wilcoxon 秩和檢驗。

3 結果

3.1 OA 對HT-29 細胞生長有抑制作用

MTT 比色法檢測OA 對IL-6 刺激下HT-29 細胞活力的影響。如圖1 所示，與對照組相比，IL-6刺激使HT-29 細胞的存活率明顯提高，其活力值為145.49% （P＜0.05）。40、80、120 μmol·L－1的OA 干預24 h 后，IL-6 刺激的細胞存活率下降，具有明顯的濃度依賴性。為了進一步驗證這些結果，通過倒置顯微鏡觀察OA 對HT-29 細胞密度的影響。如圖2 所示，OA 處理可劑量依賴性地降低HT-29 細胞的密度。綜上所述，OA 可抑制IL-6刺激后HT-29 細胞的生長。

圖1 OA 對HT-29 細胞增殖能力的影響Fig 1 Effect of OA on the proliferation of HT-29 cells

圖2 OA 對HT-29 細胞密度的影響（200×）Fig 2 Effect of OA on HT-29 cell density （200×）

3.2 OA 誘導HT-29 細胞凋亡

圖3 結果表明，與空白對照組相比，10 ng·mL－1IL-6 刺激后凋亡細胞比例無明顯改變（P＞0.05）。相反，OA 以劑量依賴的方式顯著增加早期和晚期凋亡細胞的百分比，與單獨用IL-6刺激的細胞相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，DAPI 染色檢測了凋亡的HT-29 細胞的細胞形態、細胞質凝聚和細胞核碎裂的程度。圖4 結果顯示，經OA 處理的HT-29 細胞的細胞核染色較未經OA 處理的HT-29 細胞染色強度更強，表明OA可促進HT-29 細胞凋亡。

圖3 Annexin V/PI 流式細胞儀檢測OA 對HT-29 細胞凋亡的影響Fig 3 Annexin V/PI flow cytometry of OA on HT-29 cell apoptosis

圖4 DAPI 染色觀察OA 對HT-29 細胞凋亡的影響（200×）Fig 4 DAPI staining of OA on the apoptosis of HT-29 cells （200×）

3.3 OA 可誘導HT-29 細胞中Caspase-3 的活化

Caspase-3 的激活通過比色法進行檢測。Caspases 是胞質內天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡反應中的關鍵蛋白。Caspases的激活對執行凋亡功能非常重要。如圖5 所示，IL-6 可抑制Caspase-3 的活化。而OA 可顯著誘導HT-29 細胞Caspase-3 的活化，且呈劑量依賴性。與IL-6 刺激的HT-29 細胞相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.4 OA 阻斷HT-29 細胞G1/S 期進程

圖5 OA 對HT-29 細胞Caspase-3 活力的影響Fig 5 Effect of OA on the Caspase-3 activity of HT-29 cells

在細胞周期中，G1期向S 期的轉換是細胞調節細胞周期進程從而調節細胞增殖的兩個主要檢查點之一。因此，通過PI 染色和熒光激活細胞分選分析，研究了OA 對HT-29 細胞G1向S 期進程的影響。如圖6 所示，未經處理的對照組、IL-6刺激的HT-29 細胞和IL-6 刺激的HT-29 細胞經不同濃度的OA（分別為40、80、120 μmol·L－1）處理后，S 期細胞比例分別為33.67%、34.81%、29.19%、26.31%和21.30%。此外，采用集落形成實驗檢測了OA 對HT-29 細胞周期的影響。如圖7 所 示，40、80、120 μmol·L－1的OA 作 用24 h，可使IL-6 刺激的細胞集落形成率分別降低至79.68%、35.44%和23.00%（P＜0.05）。這些結果表明，OA 通過阻斷細胞周期從G1期到S 期的進程來抑制HT-29 細胞的增殖。

圖6 OA 對HT-29 細胞周期的影響Fig 6 Effect of OA on the cell cycle of HT-29

3.5 OA 抑制IL-6 介導的HT-29 細胞STAT3 活化

許多人類癌細胞株，包括HT-29，在體外并不組成性地表達p-STAT3，本研究通過給予HT-29 細胞外源性IL-6 刺激來誘導STAT3 的激活，并對細胞裂解產物進行Western blot 分析以確定STAT3 在Tyr705 處的磷酸化水平。如圖8 所示，IL-6（10 ng·mL－1）刺激HT-29 細胞后，p-STAT3蛋白表達水平顯著升高，而OA 顯著抑制其磷酸化，且呈劑量依賴性。

3.6 OA 下調HT-29 細胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15 的表達

為探討OA 對IL-6 刺激HT-29 細胞后的作用機制，采用RT-PCR 和Western blot 方法檢測OA 對IL-6/STAT3 信號通路的重要靶基因表達水平的影響。這些基因包括抗凋亡的Bcl-2，促凋亡的Bax、p15以及促增殖的CyclinD1和CDK4。如 圖9 所示，IL-6 刺激后這些基因的mRNA 表達水平均無明顯變化，而在蛋白水平上，IL-6 刺激可明顯引起CyclinD1 和CDK4 的表達升高，對Bcl-2、Bax、p15 的表達無明顯變化。而經過OA 處理后，OA 可顯 著 降低IL-6 介導 的Bcl-2、CyclinD1、CDK4三個基因的表達；可上調Bax和p15的基因和蛋白的表達水平，但在不同濃度的OA 處理的HT-29 細胞中，促凋亡Bax 的表達水平顯著升高。

圖7 OA 對HT-29 細胞集落形成能力的影響Fig 7 Effect of OA on the colony forming ability of HT-29 cells

圖8 OA 對HT-29 細胞STAT3 活化的影響Fig 8 Effect of OA on the activation of STAT3 in HT-29 cells

4 討論

圖9 OA 對HT-29 細胞IL-6/STAT3 信號通路的影響Fig 9 Effect of OA on IL-6/STAT3 signaling pathway in HT-29 cells

近年研究表明，IL-6 介導的STAT3 信號通路的失調與人類各種實體瘤（包括CRC）的發展密切相關，異常激活的STAT3 可通過促進腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲、轉移和抑制凋亡來促進腫瘤的發生和發展[16-17]。因此，本文研究IL-6/STAT3 信號通路的調節，以開發新的CRC 治療藥物。IL-6 是促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的關鍵，通過結合IL-6R 和共受體糖蛋白130（gp130）起作用，從而激活相關的Janus 激酶（JAK）。隨后，活化的JAKs 使gp130 磷酸化，從而導致STAT3的募集和激活，STAT3 是細胞存活和增殖所必需的重要轉錄因子，其異常激活可介導各種細胞周期蛋白D1（CyclinD1），CDK4、Bcl-1基因的過表達導致細胞過度增殖和凋亡抗性增加，這可能導致腫瘤的發生和發展[18-21]。

本研究結果顯示，OA 能顯著抑制IL-6 導致的人結腸癌HT-29 細胞過度增殖，DAPI 染色和AnnexinV 檢測均發現OA 有明顯的促凋亡作用，Caspase-3 顯著激活，均呈現明顯的劑量依賴性。流式細胞儀結果表明，OA 將HT-29 細胞周期阻滯在G1期。此外，OA 可顯著抑制IL-6 介導的STAT3 激活并呈劑量依賴性，且抑制STAT3 下游基 因Bcl-2、CyclinD1和CDK4的mRNA 和 蛋白表達，同時可增加Bax、p15的表達。因實驗目的在于評價OA 的藥效作用及其潛在機制，本實驗未設置陽性藥物組。本實驗結果表明，OA 可以通過調節IL-6/STAT3 信號通路及其靶基因來有效抑制人結腸癌細胞的增殖并促進其凋亡。因此，OA 有可能作為未來防治結腸癌的潛在藥物。