基于化學(xué)計量學(xué)的金釵石斛不同加工品和干燥品的紅外光譜分析

張悅，陳瑩，郭怡博，魏鑫鑫，陳建波，孫志蓉*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院，北京 0488）

金釵石斛Dendrobium nobileLindl.是藥用石斛的基原植物之一，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，以地上莖入藥，干鮮兩用，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[1]，其主要有效成分為金釵石斛多糖、生物堿等[2]，是石斛夜光丸、脈絡(luò)寧注射液等中成藥的主藥，可開發(fā)為以金釵石斛為原料的膠囊、含片等保健品，市場需求量大[3-4]。目前，金釵石斛已實現(xiàn)人工規(guī)模化栽培，主要產(chǎn)區(qū)有貴州、四川、云南等地，其傳統(tǒng)初加工方法為“除去雜質(zhì)→脫葉鞘→殺青→發(fā)汗→整形→干燥”[5]，加工環(huán)節(jié)復(fù)雜，加工量少且費時費力，加上金釵石斛鮮莖的表皮致密，莖內(nèi)部含大量水分，自然晾干或烘干的干燥時間較長且生產(chǎn)效率低，如何在保證金釵石斛品質(zhì)前提下精簡加工環(huán)節(jié)、提高干燥和產(chǎn)出效率成為石斛產(chǎn)業(yè)規(guī)模化發(fā)展亟需解決的問題。然而，對石斛產(chǎn)地初加工的研究主要集中在加工工藝對其加工品外觀形狀、色澤等物理性狀和多糖、生物堿等有效成分含量的影響[5-7]，對不同加工和干燥方法處理的金釵石斛加工品整體化學(xué)成分指紋圖譜的研究較少。

傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）可以反映中藥譜圖的整體化學(xué)成分信息，具有整體、快速、無損鑒別的特點[8-9]，同時結(jié)合相似度評價、聚類分析、主成分分析等化學(xué)計量學(xué)方法，可以挖掘中藥材原始光譜的潛在信息[10]，在中藥材真?zhèn)舞b別[11-12]、樣品產(chǎn)地快速鑒別[13-14]、藥材質(zhì)量評價[15-17]等方面均有應(yīng)用。本文以不同加工和不同干燥方法處理的金釵石斛加工品和干燥品為研究對象，應(yīng)用傅里葉紅外光譜和相似度評價、主成分分析與聚類分析化學(xué)計量學(xué)方法，比較不同加工和干燥方法對金釵石斛整體化學(xué)指紋圖譜的影響，探究紅外光譜法在鑒別和評價金釵石斛加工品質(zhì)量方面應(yīng)用的可行性，為金釵石斛不同加工品和干燥品的質(zhì)量評價與控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來源和加工

金釵石斛樣品分別于其采收期（10月份）采自貴州赤水市旺隆、官渡、鴨嶺和紅花4 個金釵石斛種植基地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫志蓉教授鑒定為金釵石斛Dendrobium nobileLindl.的新鮮莖。

按文獻(xiàn)[5]中金釵石斛加工方法處理得到1 ～9 號加工品（見表1）。金釵石斛不同干燥品制備方法如下：烘干品（H1 ～H5）經(jīng)55 ℃鼓風(fēng)烘干后粉碎得到；凍干品（D1 ～D5）經(jīng)冷凍干燥（－60℃、1 Pa 下預(yù)凍7 h，干燥10 h）后粉碎得到；榨汁后噴霧干燥品（Z1 ～Z5）經(jīng)榨汁機(jī)榨取汁液后，噴霧干燥而得。

表1 樣品信息表Tab 1 Sample information

1.2 儀器與試藥

METTLER-AE240 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；DHG-9140A 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LGJ-12 冷凍干燥機(jī)（松源華興公司）；ZN-02 小型粉碎機(jī)（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）；Spectrum GX FTIR 紅外光譜儀（美國Perkin Elmer），DTGS 檢測器；溴化鉀（KBr，純度為99.9%，化學(xué)試劑研究所）；金釵石斛多糖為課題組自制（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）[18]。

1.3 紅外光譜測定方法

1.3.1 紅外圖譜掃描 研磨溴化鉀空白片，掃描本底。將適量藥材粉末與溴化鉀混合研磨（樣品與溴化鉀之比約為2∶100），壓片，掃描，獲得樣品的紅外一維譜圖。掃描條件：光譜測量范圍4000 ～400 cm－1，光譜分辨率為4 cm－1，掃描信號累加16 次，掃描時實時扣除水和二氧化碳的干擾。

1.3.2 儀器精密度考察 同一金釵石斛樣品，按照“1.3.1”項下方法壓片后檢測，連續(xù)掃描5次，對所得圖譜進(jìn)行相似度比較，其相關(guān)系數(shù)為0.9997 ～1.000，結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.3.3 樣品重現(xiàn)性考察 分別取同一批金釵石斛樣品5 份，按照“1.3.1”項下方法分別壓片后測定，對所得圖譜進(jìn)行相似度比較，其相關(guān)系數(shù)為0.9920 ～0.9999，結(jié)果表明樣品具有良好的重現(xiàn)性。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用Perkin-Elmer 公司的Spectrum V6.3.5 操作軟件，對樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖譜預(yù)處理，預(yù)處理過程包括基線校正、歸一化和比對。采用Spectrum V6.3.5 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，并利用其求導(dǎo)功能得到樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜，平滑點數(shù)為13。分別應(yīng)用SMICA 14.1 軟件和SAS 8.2 軟件對樣品紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛不同加工品和干燥品的紅外光譜比較

2.1.1 一維紅外光譜圖比較 9 種不同加工方法處理的金釵石斛樣品的一維紅外光譜見圖1，可知9 種加工品之間的一維光譜圖差異較小，峰位和峰形較為相似，相似度為0.9828 ～0.9988（見表2），說明不同加工品主體化學(xué)成分相似。對各加工品紅外圖譜共有峰進(jìn)行歸屬（見表3），結(jié)果表明9 種加工品的紅外光譜峰在2852 cm－1處有所不同，水燙＋烘干（5）、水燙＋發(fā)汗＋烘干（6）、40℃真空干燥（7）的2852 cm－1左右處譜峰較為明顯，而其他加工品在此處譜峰較弱。2923 cm－1與2852 cm－1分別為亞甲基的碳?xì)浞磳ΨQ伸縮振動峰與對稱伸縮振動吸收峰，歸屬為長鏈化合物，推測上述3 種金釵石斛加工品長鏈化合物較多。

3 種干燥方法處理的金釵石斛干燥品一維紅外圖譜見圖2，可知金釵石斛烘干品與凍干品紅外光譜整體上相似度較高，相似度為0.9522 ～0.9972（見表4），組內(nèi)相似度分別為0.9697 ～0.9972 和0.9812 ～0.9985。榨汁后噴霧干燥品紅外光譜與前兩者差異較大，表現(xiàn)為無1739、1506、1461、1331 cm－1峰，而在900 cm－1之后峰要相對多些，可能原因是石斛水提取物進(jìn)行噴霧干燥獲得樣品較其他干燥方法成分損失較多[19]。對比金釵石斛多糖紅外圖譜，1739 cm－1左右為金釵石斛多糖的酯羰基C ＝O 伸縮振動吸收峰，950 cm－1以下為糖環(huán)骨架振動吸收的多個指紋特征峰，1600 ～1300 cm－1為芳香類物質(zhì)特征譜段[20]，1506 cm－1為芳香環(huán)骨架伸縮振動吸收峰，1461 cm－1附近的吸收峰可能為芳香環(huán)骨架伸縮振動或C-H 彎曲振動，1331 cm－1處為C-H 彎曲振動吸收峰，推測榨汁后噴霧干燥品的金釵石斛多糖、芳香類物質(zhì)的種類及含量與凍干品、烘干品可能存在差異。由表4 可知，榨汁后噴霧干燥品組內(nèi)相似度為0.8900 ～0.9933，與其他2種干燥方法樣品相似度為0.6687～0.8329，驗證其化學(xué)成分的種類與含量有所不同，可以與另外兩種加工品區(qū)分。

表2 9 種加工品一維紅外光譜之間相關(guān)系數(shù)Tab 2 Correlation coefficients among the one-dimensional infrared spectra of 9 processed products

圖1 9 種加工品的一維紅外譜圖Fig 1 One-dimensional infrared spectra of 9 processed products

表3 金釵石斛加工品紅外光譜各吸收峰官能團(tuán)的振動方式及主要歸屬Tab 3 Vibration mode of absorption peak functional group and the main peak attributable of processed products of Dendrobium nobile Lindl.

2.1.2 紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜圖比較 紅外二階導(dǎo)數(shù)圖譜可以將譜圖中的重疊峰進(jìn)一步分開，增大譜圖分辨率[20]。選擇9 種金釵石斛加工品差異較大的波段1800 ～800 cm－1進(jìn)行二階求導(dǎo)得到9種加工品二階譜圖（見圖3），結(jié)果在波數(shù)1060、1035 cm－1處，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋發(fā)汗＋烘干（3）、水燙＋砂炒＋烘干（4）的吸收峰較強(qiáng)，其他6 種加工品吸收峰較弱。傳統(tǒng)加工（1）、水燙＋烘干（5）、水燙＋發(fā)汗＋烘干（6）在1740 ～1593 cm－1及1593 ～1515 cm－1有許多明顯的小峰，以水燙＋發(fā)汗＋烘干（6）的吸收峰最強(qiáng)。二階導(dǎo)數(shù)圖譜中1593 cm－1、1559 cm－1、1508 cm－1為芳環(huán)骨架伸縮振動吸收峰，以及1737、1635 cm－1等C ＝O 伸縮振動吸收峰為金釵石斛內(nèi)芳香類物質(zhì)的指紋特征峰[20]。

表4 3 種干燥品一維紅外光譜之間相關(guān)系數(shù)Tab 4 Correlation coefficients among the one-dimensional infrared spectra of 3 dried products

圖2 3 種干燥品的一維紅外譜圖Fig 2 One-dimensional infrared spectra of 3 dried products

圖3 9 種加工品的紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖Fig 3 Infrared second derivative spectra of 9 processed products

通過二階導(dǎo)數(shù)圖譜（見圖4），烘干與凍干品主 要 在1126、1107 cm－1處 和1054、1020 cm－1處的相對峰強(qiáng)存在差異。具體表現(xiàn)為烘干品在1126 cm－1與1107 cm－1吸收峰強(qiáng)度一致，凍干品在1107 cm－1峰強(qiáng)度弱于1126 cm－1。烘干品在1054 cm－1與1020 cm－1處吸收峰強(qiáng)度一致，而凍干品在1054 cm－1左右吸收峰強(qiáng)度弱于1020 cm－1處。上述吸收峰歸屬于金釵石斛多糖二階導(dǎo)數(shù)特征峰，峰強(qiáng)差異說明烘干品與凍干品中金釵石斛多糖種類與含量可能存在差異。榨汁后噴霧干燥品與烘干、凍干品的差異明顯，在1200 cm－1前只有1469 cm－1處峰較強(qiáng)，在1200 cm－1吸收峰都較弱，但榨汁后噴霧干燥品二階導(dǎo)數(shù)光譜與金釵石斛多糖二階導(dǎo)數(shù)光譜峰位與峰形相似度較高，可能與處理過程中多糖類成分溶出有關(guān)。

圖4 3 種干燥品的紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖Fig 4 Infrared second derivative spectra of 3 dried products

2.2 聚類分析和主成分分析

2.2.1 聚類分析 聚類分析可以將樣本依據(jù)某些特征加以歸類并建立樣本與樣本之間相似關(guān)系或親疏關(guān)系[21]。以金釵石斛不同加工品和干燥品的紅外光譜主要峰位的峰強(qiáng)數(shù)據(jù)為變量，導(dǎo)入SAS軟件，以離差平方和法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)歐式距離為10.0 時，可分為兩大類，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋發(fā)汗＋烘干（3）、水燙＋砂炒＋烘干（4）聚為一大類，其余為另一大類，可初步推測“砂炒”環(huán)節(jié)對金釵石斛的整體成分影響較大，為金釵石斛加工中較為重要的加工環(huán)節(jié)；當(dāng)歐式距離為5.0 時，分為三類，第一類為傳統(tǒng)加工（1）與水燙＋烘干（5），第二類為6、7、8、9，其中6 為水燙＋發(fā)汗＋烘干，與40 ℃真空干燥（7）、60 ℃真空干燥（8）、80 ℃真空干燥（9）在歐式距離為1.25 時區(qū)分，第三類為2、3、4，均具有“砂炒”環(huán)節(jié)。

3 種干燥品聚類見圖5B，當(dāng)歐式距離為13.0時分為兩大類，第一類為烘干品（H1 ～H5）與凍干品（D1 ～D5），另一類為榨汁后噴霧干燥品（Z1 ～Z5）；當(dāng)歐式距離為5.0 時，分為三類，第一類為烘干品（H4）與凍干品（D1 ～D5），第二類烘干其余4 個樣品，第三類為榨汁后噴霧干燥的5 個樣品。推測金釵石斛不同干燥品化學(xué)成分存在差異，其中烘干品、凍干品主體化學(xué)成分較為相近且與榨汁后噴霧干燥品明顯區(qū)分。

2.2.2 主成分分析 主成分分析通過數(shù)據(jù)降維，用少量主成分來描述多種指標(biāo)之間的聯(lián)系，用較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量的信息[22]。將金釵石斛不同加工品和干燥品的紅外光譜主要峰位的峰強(qiáng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SMICA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖6 所示。9 種不同加工品的2 個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)99.6%，3 種干燥品2 個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)到92.9%，可較好地反映金釵石斛不同加工品和干燥品紅外光譜圖信息。如圖6A 所示，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋發(fā)汗＋烘干（3）、水燙＋砂炒＋烘干（4）分布較為聚攏且與其他加工品距離較遠(yuǎn)，聚為一類；其余6 種加工方法聚為一類，其中40℃真空干燥（7）、60℃真空干燥（8）、80℃真空干燥（9）分布較為聚攏，上述結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致，驗證推論。

圖6B 中3 種干燥方法可得到較好的分離，除烘干樣品H4 外，其他樣品分別按3 種干燥方法組內(nèi)聚攏，組間分離趨勢明顯，說明不同干燥方法處理的金釵石斛樣品之間化學(xué)成分存在一定差異，與紅外光譜及聚類分析結(jié)果一致。此外，5個凍干品分布較為集中，說明凍干工藝獲得加工品的品質(zhì)一致性較高，與相似度分析結(jié)果一致。

圖5 不同加工品（A）和干燥品（B）的一維紅外光譜聚類分析圖Fig 5 Cluster analysis diagram of one-dimensional infrared spectra of different processed（A）and dried products（B）

3 討論

本文在課題組前期探究傳統(tǒng)加工、砂炒＋烘干等9 種加工方法對金釵石斛質(zhì)量影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從藥材整體化學(xué)指紋圖譜的角度比較不同金釵石斛加工品化學(xué)信息的差異，結(jié)果表明采用紅外光譜與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合的方法可以實現(xiàn)對金釵石斛不同加工品質(zhì)量的快速判別與評價。

從9 種加工品二階紅外導(dǎo)數(shù)光譜可以看出，其二階紅外導(dǎo)數(shù)光譜在1060、1035、1740 ～1593 及1593 ～1515 cm－1處圖譜峰差異較大，可加以區(qū)分。具體表現(xiàn)在砂炒＋烘干、砂炒＋發(fā)汗＋烘干、水燙＋砂炒＋烘干在1060、1035 cm－1處峰強(qiáng)較強(qiáng)，傳統(tǒng)加工、水燙＋烘干、水燙＋發(fā)汗＋烘干在1740 ～1593 cm－1及1593 ～1515 cm－1峰數(shù)較多。另外，本研究發(fā)現(xiàn)“砂炒”環(huán)節(jié)對金釵石斛的整體成分影響較大，兼具殺青、脫葉鞘、整形功能[5]，是金釵石斛加工中的重要環(huán)節(jié)。

圖6 不同加工品（A）和干燥品（B）一維紅外光譜主成分分析圖Fig 6 Principal component analysis diagram of one-dimensional infrared spectra of different processed products（A）and dried products（B）

烘干品、凍干品與榨汁后噴霧干燥品可利用紅外光譜法進(jìn)行鑒別區(qū)分，榨汁后噴霧干燥品的一維紅外光譜與烘干品和凍干品的差異明顯，表現(xiàn)為無1739、1506、1461、1331 cm－1峰，而在900 cm－1之后峰要相對多些，可加以區(qū)分。烘干品與凍干品可利用二階導(dǎo)數(shù)光譜1126 和1107 cm－1、1053 和1020 cm－1處的相對峰強(qiáng)加以區(qū)分。凍干品間均一性高，但榨汁后噴霧干燥品與其他2 種干燥品主體化學(xué)成分差異較大。傳統(tǒng)烘干法操作簡便、成本低且對于設(shè)備要求不高，適用于石斛藥材加工[23]；冷凍干燥是在高真空度、低溫條件下通過凍結(jié)升華方法脫去水分，可抑制微生物的生長和酶的作用，具有保持產(chǎn)品的色澤和品質(zhì)的特點[24]，但其操作復(fù)雜，加工成本較高[25]，適用于石斛或其保健型食品的保鮮[26]；石斛榨汁后進(jìn)行噴霧干燥獲得的干燥品由于瞬時高溫，干燥時間較短，可保持原有色澤且抗氧化活性較高，適用于石斛提取物相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)[19]。因此在以金釵石斛為原料的加工過程中，可根據(jù)實際生產(chǎn)成本、生產(chǎn)目標(biāo)與產(chǎn)品質(zhì)量選擇適宜的干燥方法以滿足生產(chǎn)需要。