基于4種皂苷的定量分析評價干燥方式對菊葉薯蕷有效成分的影響

馬境謙，崔乃菠，余河水，3，李正，，3，劉二偉，別松濤，3*（.天津中醫藥大學 中藥制藥工程學院，天津 3067；.組分中藥國家重點實驗室，天津 3067；3.中藥制藥工程市級實驗教學示范中心，天津 3067）

干燥是中藥材產地加工的重要環節，通過干燥處理可有效防止中藥霉變、蟲蛀、變色等現象的產生，方便藥材運輸及儲藏。歷史文獻中記載了大量的傳統干燥方式[1-2]，其中曬干法和陰干法因成本低、操作簡單而廣泛應用于白芷、紅參、黃芩等藥材的干燥[3-5]。隨著中藥工業化規模生產，熱風干制逐漸受到人們的關注，因其不受天氣因素制約及干燥時間、溫度可控等優點，被廣泛應用于山藥、大棗、柴胡、三七、山豆根、五味子等中藥材的干燥[6-8]。

菊葉薯蕷（Dioscorea compositaHemsl.）是薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞性草本植物[9]，原產于墨西哥，因用于提取甾體激素藥物起始原料皂素而聞名[10]。菊葉薯蕷的有效成分為根莖中存在的呋甾型與螺甾型甾體皂苷[11-12]，具有祛痰截瘧、化濕利水、解毒消腫等功能，被用于風濕麻木、糖尿病、骨質疏松、肥胖和高尿酸血癥的治療[13]；同時在現代醫學研究中，菊葉薯蕷的抗炎、抗過敏、抗菌等藥用作用被不斷開發[14]。3年生菊葉薯蕷根莖的鮮品，單株重約15 kg，富含水分和淀粉，采挖后不宜儲藏和運輸，由于種植規模及產能的逐漸擴大，產地干制工序成為菊葉薯蕷產地加工的關鍵步驟。當前，工業上多采用將采收后菊葉薯蕷根莖的鮮品去除外部泥沙、切厚片，經傳統干燥獲得干片的方式進行產地干燥。中藥材干燥的過程與其藥性的形成密切相關[15]，目前干燥方式對菊葉薯蕷皂苷類有效成分的影響未見報道。

本研究選用云南省會澤縣3年生菊葉薯蕷根莖鮮品作為實驗材料，采用陰干法、曬干法、60 ℃熱風干制的方式，以原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷作為評價指標，采用HPLC-ELSD 的方法測定其含量變化，篩選出適宜的產地干制方式，旨在為菊葉薯蕷的產地加工及質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695HPLC 色譜系統（四元泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和Empower 色譜工作站）、2424 蒸發光散射檢測器（Waters）；SB-5200DTD 型數控超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AB135-S 電子分析天平（瑞典 Mettler Toledo 公司）；中草藥粉碎機（天津市泰斯儀器有限公司）；全自動新型鼓風干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；Milli-Q超純水處理系統（美國 Millipore 公司）。

1.2 試藥

原薯蕷皂苷對照品（批號：P13A9F58572，純度≥98%）、偽原薯蕷皂苷對照品（批號：S07M6L1，純度≥97%）、重樓皂苷Ⅱ 對照品（批號：P11A11F73858，純度≥ 98%）、薯蕷皂苷對照品（批號：Y20A10Z95575，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；無水乙醇（色譜純，天津風船化學試劑科技有限公司）；實驗用水為超純水。菊葉薯蕷藥材，采自云南省會澤縣，采收時間為2020年4月份，經天津中醫藥大學中藥鑒定教研室張麗娟、宋新波教授鑒定為薯蕷科植物Dioscorea compositaHemsl.的根莖鮮品。

2 方法與結果

2.1 不同干燥方式下菊葉薯蕷樣品的制備

新鮮的菊葉薯蕷樣品，清水沖洗，洗凈外部泥沙，切厚度為2 ～4 mm 厚片，將菊葉薯蕷片隨機分成4 組，每組約1000 g，按對應的方式處理，計算干燥樣品折干率。

第一組為陰干法干制薯蕷，將菊葉薯蕷厚片均勻攤開于篩網中，置于室內、陰涼、避光、通風處，干燥168 h。

第二組為鮮品薯蕷，切制厚片，不做任何干燥處理。

第三組為曬干法干制薯蕷，將菊葉薯蕷厚片均勻攤開于篩網中，置于室外日光下或光線佳處晾曬，夜間收回，干燥144 h。

第四組為熱風干制薯蕷，采用熱風干燥的方法制備，60℃，風速0.15 m·s－1，干燥48 h。

2.2 菊葉薯蕷中水分、灰分及浸出物測定

菊葉薯蕷中水分的測定參照2020年版《中國藥典》通則0832 項下的烘干法，菊葉薯蕷中灰分的測定參照2020年版《中國藥典》通則2302 項下的總灰分測定法，菊葉薯蕷中浸出物的測定參照2020年版《中國藥典》通則2201 項下的水溶性浸出物冷浸法，結果見表1。

2.3 溶液的制備

表1 不同干燥方式干燥菊葉薯蕷的水分、總灰分、浸出物、干燥時間、折干率Tab 1 Moisture，ash，extract，drying time and drying rate of Dioscorea composita Hemsl.dried by different drying methods

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加70%乙醇定容至10 mL 量瓶中，分別制成含原薯蕷皂苷1.028 mg·mL－1、偽原薯蕷皂苷1.023 mg·mL－1、重樓皂苷Ⅱ1.026 mg·mL－1、薯蕷皂苷1.024 mg·mL－1的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取適量菊葉薯蕷干片粉碎，過40 目篩，精密稱定菊葉薯蕷粉末0.67 g，置100 mL 具塞三角瓶中，加70%乙醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲提取30 min（功率360 W，頻率40 kHz），放冷后用70%乙醇補足重量，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱為Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～5 min，25% ～30%A；5 ～6 min，30% ～31%A；6 ～10 min，31%A；10 ～20 min，31% ～60%A；20 ～30 min，60% ～95%A；30 ～32 min，95%A；32 ～35 min，95%～25%A）；體積流量為1.0 mL·min－1，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測器為蒸發光散射檢測器（漂移管溫度70 ℃，氣體流速2.8 L·min－1）。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密吸取適量“2.3.1”項下的各對照品溶液，加70%乙醇按照1、2、4、6、10、15 倍稀釋獲得系列梯度的混合對照品溶液。按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，以對照品質量濃度的對數值為橫坐標（X），以峰面積的對數值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。得各成分校正曲線方程，結果見表2，4 種皂苷在各自線性范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5.2 檢測限（LOD）與定量限（LOQ）考察取“2.3.1”項下各對照品溶液，用70%乙醇逐步稀釋，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，以信噪比3∶1 和10∶1 分別計算4 種皂苷的檢測限與定量限，結果見表2。

2.5.3 精密度試驗 取混合對照品溶液（臨用新配），按“2.4”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄各成分峰面積值，計算原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷峰面積的RSD值分別為2.2%、3.2%、3.7%、3.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取熱風干制的菊葉薯蕷干燥樣品，按“2.3.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，測得原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷含量RSD分別為1.7%、2.0%、2.4%、2.3%，結果表明方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取熱風干制的菊葉薯蕷干燥樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件分別于 0、2、4、6、10、12 h進樣測定，測得原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷的峰面積RSD值分別為4.4%、2.1%、4.1%、2.3%，表明供試品溶液在制備后12 h內穩定。

2.5.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的熱風干制的菊葉薯蕷干燥樣品6 份，分別準確加入4種對照品適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，計算原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷平均加樣回收率分別為98.3%、97.9%、98.7%、98.2%，RSD（n＝6）分別為2.0%、2.1%、2.3%、2.8%。

2.6 含量測定

取“2.1”項下菊葉薯蕷樣品，每組各3 份，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件進行測定。各供試品（按干品計算）色譜圖見圖1，原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷的含量見表3。

圖1 菊葉薯蕷鮮品及各干制品的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Dioscorea composita Hemsl.fresh and dried by different methods

表3 菊葉薯蕷鮮品及各干制品中4 種皂苷的含量(n ＝3，mg·g－1)Tab 3 Contents of 4 saponins in Dioscorea composita Hemsl.fresh and dried by different methods (n ＝3，mg·g－1)

與菊葉薯蕷鮮品相比，陰干法、曬干法干制4 種皂苷的含量變化較大，其中原薯蕷皂苷降低、偽原薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷含量升高；60 ℃熱風干制的菊葉薯蕷樣品與鮮品相比，4 種皂苷的含量差異最小。

3 討論

3.1 HPLC-ELSD 法定量分析菊葉薯蕷中4 種皂苷的含量

菊葉薯蕷中的皂苷類成分發色基團較少，在紫外低波長200 ～210 nm 處有末端吸收，容易受溶劑等因素影響，基線不穩定且檢測困難，影響含量測定的準確性；而在200 ～210 nm 以外波長區域測定皂苷組分時，部分皂苷組分重疊，限制了UV檢測器的使用[16]。由于菊葉薯蕷中皂苷類成分組成復雜且結構相差不大，極性僅有細微的不同，采用單一溶劑的流動相實現良好分離效果的可能性很小，因此示差檢測器（RI）檢測器很少用于皂苷類的分析。雖然理論上柱前衍生可以彌補UV 和RI檢測器的不足，但由于皂苷的立體結構及功能性基團羥基取代率的不同使部分皂苷不易衍生化，而且某些皂苷可能生成多個衍生物而進一步增加對皂苷類成分定量分析的復雜性[17-18]。ELSD 是一種非質量選擇性檢測器，其檢測效果不受樣品分子中官能團影響，對各種物質均有響應，溶劑在漂移管中的蒸發消除了溶劑峰對基線的干擾，波動小[19]。目前，ELSD 已廣泛應用于皂苷類、糖類、內酯類及部分生物堿等成分的檢測[20-22]。本文采用HPLCELSD 定量分析菊葉薯蕷4 種皂苷的含量，蒸發光信號響應良好，4 種指標成分分離度高，峰形佳且相互無干擾，從而克服UV 檢測器末端吸收性差、基線不平穩等因素的干擾。

3.2 干燥對菊葉薯蕷水分、灰分、浸出物及折干率的影響

不同干燥方式干燥菊葉薯蕷的折干率在28.13%～32.08%，其中，60℃熱風干燥僅需要48 h，而陰干法需要168 h，曬干需要144 h。采用不同干燥方式干燥菊葉薯蕷樣品（參照薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea compositaThunb.），依據2020年版《中國藥典》對水分、灰分和浸出物進行規定[23]：其中水分在9.03%～10.98%，均小于16%，符合藥典規定；灰分在3.51%～3.68%，均小于4%，符合藥典規定；浸出物含量在18.24%～21.70%，高于藥典要求的不小于7%。通過上述各干燥樣品的外在指標分析，3 種干燥方式在水分、灰分、浸出物及折干率上沒有明顯的差別，從干燥時間及環境可控的角度，熱風干燥更加適合于菊葉薯蕷規模化產地加工。

3.3 干燥對菊葉薯蕷有效成分保留方面的影響

不同干燥方式所獲得的干品及鮮品定量分析結果表明，菊葉薯蕷中4 種皂苷的含量因為干燥方式的不同存在差異，該結果與文獻[24]闡明的“干燥是中藥材加工的關鍵技術，干燥的過程也是中藥材藥性形成的過程”的研究結論相吻合。從有效成分保留方面來看，60℃熱風干制更適合于菊葉薯蕷的產地加工。陰干法干制和曬干法干制導致菊葉薯蕷皂苷成分顯著變化的原因，可能在于這兩種干制的方式時間長、條件溫和，非常適宜菊葉薯蕷本身的苷酶及外界微生物（曲霉、酵母等）發揮酶解或微生物轉化作用，從而導致原薯蕷皂苷等原生皂苷含量降低，而薯蕷皂苷等次生皂苷的含量升高[25]。60℃熱風干制4 種皂苷類成分變化不大，可能是采用加熱處理能夠“殺酶保苷”，避免有效成分水解[26]。

文章采用HPLC-ELSD 法同時定量測定菊葉薯蕷中4 種皂苷，方法簡便、快捷、準確、重現性好，可用于菊葉薯蕷及其他含皂苷類藥材的質量控制；研究基本闡明了3 種干燥方式對菊葉薯蕷中4 種皂苷含量的影響，可為菊葉薯蕷的產地干燥加工及質量控制提供參考。