基于串聯質譜標簽定量蛋白質組學技術的芍甘附子湯治療類風濕關節炎作用機制研究

董琳琳，石璐，苗豐，豐晨然，靖衛霞，賈占紅，趙一穎，孫文燕*（.北京中醫藥大學中藥學院，北京 0488；.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 0009）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，患病人群多為中老年人，且女性患病率高于男性。臨床表現為關節腫脹、骨質破壞，嚴重者可致關節畸形，還可累及全身多個器官。該病病因及發病機制尚未完全明確，目前尚無根治藥物。

芍甘附子湯出自《傷寒論》，全方由白芍、附子、甘草組成，臨床治療RA 有確切療效[1]。本課題組前期研究結果表明，芍甘附子湯對牛Ⅱ型膠原（C Ⅱ）誘導的關節炎（CIA）大鼠有明確的治療作用，可顯著改善大鼠關節腫脹，減輕關節病理損傷，但作用機制尚不明確。蛋白質組學技術是近年來新興的一種實驗方法。串聯質譜標簽（tandem mass tag，TMT）是利用化學標簽通過串聯質譜對不同樣品中的蛋白同時進行鑒定和定量的研究方法，已廣泛應用于蛋白質組學研究[2-3]。本研究通過建立CIA 大鼠模型，以足跖腫脹度及關節炎指數評分評價芍甘附子湯的藥效，采用TMT 定量蛋白質組學技術檢測芍甘附子湯對CIA大鼠滑膜組織蛋白表達的影響，進一步應用生物信息學手段對差異蛋白質進行分析，初步探究芍甘附子湯防治RA 的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級Wistar 大 鼠，雄 性，體 質 量170 ～190 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 試藥

芍甘附子湯（黑順片3 g、白芍9 g、甘草9 g）配方顆粒（北京中醫藥大學東方醫院，由北京康仁堂藥業制成，以確保藥品質量），給藥時以生理鹽水充分溶解，按照人日用量換算大鼠的等效劑量為2.1 g（生藥）·kg－1。

牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，批號：190306），不完全弗氏佐劑（IFA，Sigma 公司，批號：SLBZ0619），A955-4 質譜級乙腈（Fisher 公司），尿素、Tris（AMRESCO 公司），氨水（Sigma-Aldrich公司，批號：318612），二硫蘇糖醇（AMRESCO 公司，批號：M109-25G），碘乙酰胺（Bio-Rad 公司，批號：163-2109），甲酸（Sigma-Aldrich 公司，批號：A117-50），考馬斯亮藍R-250（Thermo Fisher Scientific 公司），V5111 質譜級胰蛋白酶（Promega公司），去離子水（Milipore 公司），蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific 公司，批號：26616），無水乙醇（北京化工廠），硫脲（Sigma-Aldrich），TMT試劑（Thermo Fisher Scientific 公司，批號：90110），CHAPS（AMRESCO 公司），Protease Inhibitor Cocktail（Roche 公司，批號：11836170001）。

1.3 儀器

YLS-7B 型足跖容積測量儀（濟南益延科技發展有限公司），分析天平（賽多利斯儀器系統有限公司），可調量程移液器（德國Eppendorf 公司），pH計（瑞士Mettler Toledo 公司），MultiskanGO1510酶標儀、超低溫冰箱、超速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），制冰機（日本Sanyo 公司），渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），金屬浴（英國Stuart 公司），電泳槽（美國Bio-Rad公司），Powerpac1000 電泳儀、脫色搖床（北京新技術應用研究所），恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學儀器有限公司），RIGOLL-3000 高效液相色譜（北京普源精電科技有限公司），Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀、SAVANT 系列真空干燥儀（美國Thermo 公司）。

2 方法與結果

2.1 動物分組、造模與給藥[4]

動物適應性飼養一周后，將2.0 g·L－1的CⅡ醋酸溶液與IFA 等體積混勻，在冰浴條件下充分乳化，并于實驗第1日（d 1）（初次免疫0.2 mL/只）及第7日（d 7）（加強免疫0.1 mL/只）進行尾根部多點皮內注射，正常組給予同等劑量的生理鹽水。實驗第21日（d 21），將造模成功即關節炎指數（arthritis index，AI）評分≥2 的大鼠按照分層隨機分配法分成模型組與芍甘附子湯組[2.1 g（生藥）/（kg·d）]，并設置正常組，每組16 只。實驗第21日（d 21）開始給藥干預，正常組和模型組均給予生理鹽水灌胃，治療組則給予2.1 g（生藥）·kg－1芍甘附子湯配方顆粒灌胃，每日1 次，連續4 周。

2.2 足跖腫脹度測定及AI 評分

于實驗前（d 0）、d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 采用足跖容積測量儀測定，足跖腫脹度計算公式為：腫脹度＝致炎后足跖體積－致炎前足跖體積。于實驗d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 對模型組和芍甘附子湯組大鼠進行AI 評分[5]。評分標準為無關節紅腫，0 分；足小趾關節紅腫，1分；趾關節及足跖關節腫脹，2 分；踝關節以下足爪腫脹，3 分；包括踝關節在內的全部足爪腫脹，4分。

2.3 TMT 定量蛋白質組學分析

2.3.1 蛋白提取 于d 49 取各組大鼠膝關節滑膜組織，每組隨機選取3 只。將研磨使用的物品用液氮預冷，樣本研磨成粉，按照1∶10（W/V）加入裂解液（7 mol·L－1尿素，1%蛋白酶抑制劑），渦旋混勻。樣本管中加入鋼珠，置于組織研磨儀中勻漿，冰上靜置30 min。13 000 r·min－1，4℃離心15 min，吸取上清液，分裝后凍存于－80℃冰箱。Bradford 法測定蛋白濃度。

2.3.2 蛋白酶解 每個樣品分別取等量蛋白加入終濃度為25 mmol·L－1的二硫蘇糖醇，渦旋混勻，37 ℃水浴1 h，取出放至室溫。加入終濃度為50 mmol·L－1的碘乙酰胺，渦旋混勻，避光室溫放置30 min。加入0.2 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨300 μL，12 000 r·min－1離心10 min，棄掉收集管底部溶液，重復3 次，再加入0.5 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨300 μL，12 000 r·min－1離心10 min。按照胰蛋白酶與蛋白1∶50 的比例，加入胰蛋白酶50 μL，37℃反應過夜。次日，加入0.2 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨100 μL，12 000 r·min－1離心10 min，重復3 次，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部。

2.3.3 TMT 標記及除鹽 從冰箱中取出TMT 試劑，平衡到室溫，將TMT 試劑離心至管底。每管加入41 μL 無水乙腈，渦旋振蕩至完全溶解，離心至管底。加入100 μL 的100 mmol·L－1三乙基碳酸氫銨復溶樣本（25 ～100 μg 蛋白），渦旋振蕩，離心至管底。將41 μL TMT 試劑按順序加入樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應1 h。標記樣品加入8 μL 5%羥胺，室溫孵育15 min 終止標記反應。HLB固相萃取柱除鹽，置于－80℃冰箱保存備用。

2.3.4 離線高pH 反相高效液相色譜分離 將TMT 的多肽樣品重溶于A 液（98% ddH2O，2%乙腈，氨水調pH 至10.0）中。經離線XBridge?peptide BEH C18高效液相色譜柱（130?，3.5 μm，4.6 mm×150 mm）分離，洗脫緩沖液B 液為98.0%乙腈，2.0%去離子水（pH 10.0）。每隔1 min 收集一管組分，共收集40 管，按順序將樣品合并為10 管組分。將收集的組分置于旋轉真空干燥儀中真空干燥，－20℃凍存備用。

2.3.5 LC-MS/MS 分析 使用Orbitrap Fusion Lumos質譜儀分析鑒定多肽混合物。使用高靈敏度模式，參數設置：每個全掃描為高速信號依賴掃描，掃描75 min。一級全掃描分辨度12 000，掃描范圍為350 ～1550m/z，AGC5e5，最大注射時間為50 ms，碰撞能量為35%，二級掃描分辨度15 000，電荷狀態篩選（包含＋2 至＋6 電荷的前體），動態消除30 s，AGC5e4，最大注射時間為22 ms。

2.3.6 數據分析 所得質譜數據經過Mascot（version 2.5.1）檢索，Scaffold Q ＋（version 4.6.2）軟件進行蛋白定量定性分析，運用UNIPROT_Rat_29954_20181130.fasta（序列總數：29954）（https：//www.uniprot.org/）數據庫對蛋白進行初步分類。對蛋白定量數據進行成對t檢驗，篩選P≤0.05 的蛋白質，為顯著差異蛋白質。利用Omics Box 軟件（版本：1.2.4）對差異蛋白質進行GO（http：//geneontology.org/）功能注釋分析，并利用KEGG（https：//www.kegg.jp/）富集分析可能的通路。

2.4 統計方法

足跖腫脹度及AI 評分均采用SAS 9.2 統計軟件進行分析。實驗數據為連續變量以±s表示，使用方差分析或非參數檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.5 結果

2.5.1 芍甘附子湯對CIA 大鼠足跖腫脹度的影響 自初次免疫后d 14 ～d 49，模型組大鼠相對于正常組左后足明顯腫脹（P＜0.01）。芍甘附子湯組與模型組比較，左后足跖腫脹度自初次免疫后d 35 ～d 49 明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），見表1。初次免疫后d 14 ～d 49，模型組大鼠相對于正常組右后足跖腫脹度升高（P＜0.01）。芍甘附子湯組與模型組比較，自初次免疫后d 35 ～d 49，右后足跖腫脹度明顯減輕（P＜0.01）（見圖1 及表2）。

圖1 各組大鼠后足腫脹情況Fig 1 Swelling of the hind foot of rats in each group A.正常組（normal group）；B.模型組（model group）；C.芍甘附子湯組（Shaogan Fuzi decoction group）；1.給藥前（before the administration）；2.給藥后（after the administration）

表1 芍甘附子湯對CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

表1 芍甘附子湯對CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與正常組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P ＜0.01；compared with the model group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

組別 左后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.11±0.07 0.21±0.12 0.24±0.13 0.30±0.14 0.36±0.11 0.43±0.13 0.42±0.12模型組 0.10±0.09 0.66±0.35** 1.16±0.55** 1.44±0.61** 1.30±0.48** 1.31±0.49** 1.25±0.59**芍甘附子湯組 0.09±0.10 0.65±0.50 1.11±0.43 1.34±0.44 0.93±0.48△ 0.88±0.55△△ 0.82±0.42△

表2 芍甘附子湯對CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

表2 芍甘附子湯對CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01。Note：Compared with the normal group，*P ＜0.05，**P ＜0.01；compared with the model group，△△P ＜0.01.

組別 右后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.08±0.07 0.17±0.09 0.21±0.09 0.29±0.11 0.32±0.12 0.42±0.12 0.41±0.14模型組 0.11±0.12 0.69±0.43** 1.00±0.52** 1.44±0.44* 1.52±0.57** 1.52±0.54** 1.37±0.56**芍甘附子湯組 0.05±0.16 0.48±0.34 1.01±0.37 1.21±0.57 0.94±0.54△△ 0.86±0.56△△ 0.78±0.42△△

2.5.2 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響 正常組AI 評分為0 分，芍甘附子湯組自初次免疫d 28 ～d 49，AI 評分較模型組明顯下降（P＜0.05），見表3。

表3 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響(±s，n ＝16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s，n ＝16)

表3 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響(±s，n ＝16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與模型組比較，△P ＜0.05。Note：Compared with the model group，△P ＜0.05.

組別 AI 評分/分d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49模型組 4.38±1.89 5.53±1.78 7.72±1.37 6.00±2.71 5.56±2.45 5.81±2.45芍甘附子湯組 5.38±1.59 6.00±3.01△ 3.81±1.91△ 3.47±2.05△ 3.94±2.05△ 3.94±2.05△

2.5.3 蛋白質組學差異蛋白質鑒定結果 以Ratio ＞1.2 或Ratio ＜0.833 且P＜0.05 為篩選條件，模型組與正常組相比較，共鑒定出85 個差異蛋白質；芍甘附子湯組與模型組相比較，共鑒定出49 個差異蛋白質（見表4 及5）。

2.5.4 GO 富集分析結果 GO 富集分析包括對芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質的分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological Process，BP）和細胞組分（cellular component，CC）的分析。圖2 為MF、BP、CC 三類富集分析差異顯著性前10 的條目。其中，MF 共涉及45 個功能，主要包括O-酰基轉移酶活性、碳水化合物結合、β淀粉樣蛋白結合、L-抗壞血酸結合、AU 堿基富集結合、3'-UTR 和AU 堿基富集結合、泛素結合酶活性、2-氧代戊二酸依賴性雙加氧酶活性、泛素樣蛋白結合酶活性、脫氧核糖核苷酸結合等（見表6）；BP 涉及到104 個生物過程，主要有RNA 剪接的負調控、通過剪接體對mRNA 剪接的負調控、肽賴氨酸羥化、mRNA 加工的負調控、干細胞分裂、有絲分裂細胞周期相變的負調控、通過剪接體調控mRNA 剪接、細胞周期相變的負調控、RNA 剪接的調控等（見表7）；CC 涉及到富含四跨素的微結構域、紡錘體基質、NatC 復合體、Rb-E2F 復合物、突觸前膜的錨固成分、突觸后膜的錨固成分、突觸膜的錨固成分、AMPA 谷氨酸受體復合物、補體成分C1 復合物、BRCA1-A 復合物等（見表8）。

表4 模型組與正常組的差異蛋白質(n ＝3)Tab 4 Differential protein between model group and normal group (n ＝3)

續表4

2.5.5 KEGG 通路富集結果 芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質的KEGG 通路富集分析涉及到剪接體、細胞衰老、人類免疫缺陷病毒1 感染、賴氨酸降解、RNA 降解、百日咳、FcγR 介導的吞噬作用、病毒性心肌炎、TGF-β信號通路、細胞周期、Apelin 信號通路等18 條相關通路，其中與RA 相關的有TGF-β信號通路、Apelin 信號通路等（見圖3 及表9）。

3 討論

RA 具有慢性、進行性、侵蝕性和破壞性的特點，致殘率高，對工作及生活影響極大。CIA模型是公認的RA 模型，其關節腫脹、炎性細胞浸潤、關節滑膜增生、血管翳形成、關節軟骨組織病變等臨床特征與RA 患者相似。并且CIA 模型的發生依賴于T、B 細胞的激活增殖，其發病機制也與RA 患者相似[6]。本研究選用Wistar 大鼠，采用CⅡ與IFA 尾根部皮內注射法復制CIA模型，注射后動物出現關節紅腫、活動受限等關節炎表現，表明模型復制成功。

芍甘附子湯中白芍具有養血斂陰、柔肝止痛功效。甘草作為補益藥，具有調和諸藥、緩急止痛功效；附子性味辛、甘，大熱，具有散寒止痛功效；諸藥共用可散寒祛濕、通絡止痛[7]。藥理研究表明，白芍有效成分白芍總苷具有明顯的抗炎作用，對于RA 療效確切，而芍藥苷占白芍總苷的90%以上，多項動物實驗證實其可顯著降低RA 模型大鼠的關節腫脹[8]。甘草具有抗炎、調節免疫的作用[9-10]。附子具有增強免疫、鎮痛、抗炎等作用[11]。本研究表明芍甘附子湯能顯著降低CIA 大鼠的關節腫脹度及AI 評分，即對RA具有治療作用，結果與文獻報道一致[7]。

表5 芍甘附子湯組與模型組的差異蛋白質(n ＝3)Tab 5 Differential protein between Shaogan Fuzi decoction group and model group (n ＝3)

圖2 生物信息學分析結果Fig 2 Bioinformatics analysis results

圖3 KEGG 通路富集結果Fig 3 KEGG pathway enrichment results

表6 差異蛋白質的主要分子功能分析Tab 6 Analysis of the main molecular functions of differential proteins

表7 差異蛋白質的主要生物過程分析Tab 7 Analysis of the main biological processes of differential proteins

表8 差異蛋白質的主要細胞組分分析Tab 8 Analysis of main cell components of differential proteins

中藥復方通過多靶點、多成分治療疾病，在整體層面上起效。蛋白質組學是對生物體內所有蛋白質的結構、功能、相互作用以及在體內的變化進行研究，進而對變化的蛋白質進行追蹤，尋找潛在的生物標志物，提示疾病可能的發病機制，從而更好地為臨床診斷及預后提供依據。蛋白質組學的研究手段與中藥復方的作用特點不謀而合。因此，本研究采用蛋白質組學方法初步探究芍甘附子湯治療RA 的作用機制。

蛋白質組學分析結果表明，與正常組相比，模型組IL1RAP、Cntn1、Copz1 等85 個蛋白表達出現顯著性差異。與模型組相比，芍甘附子湯組有49 個蛋白質表達出現顯著性差異。GO 富集分析表明這49 個差異蛋白質主要參與免疫及炎癥調控等過程，大多分布于細胞質中，多具有結合及催化活性。KEGG 分析表明差異蛋白質主要涉及18 條信號通路，其中與RA 顯著相關的為Apelin 信號通路以及TGF-β信號通路，提示芍甘附子湯可通過多種途徑發揮治療RA 的作用。

表9 差異蛋白質的主要KEGG 信號通路分析Tab 9 Analysis of the main KEGG signaling pathways of differential proteins

RA 作為一種免疫性疾病，多種免疫細胞及細胞因子的參與促進了其發生發展。而IL1RAP在RA 的發病過程中也發揮了重要作用。IL1RAP具有白細胞介素-1（IL-1）受體活性及白細胞介素-13（IL-13）受體活性，能夠加速IL-1、IL-13等促炎因子的產生，增強炎癥反應，還可激活IL-1β、NF-κB 和MAPK 信號通路[12-13]，促進疾病的發展。本研究發現，模型組與正常組相比，IL1RAP 表達上調，而芍甘附子湯組IL1RAP 表達下調，提示芍甘附子湯可能通過下調IL1RAP表達，調節相應炎性細胞因子水平，緩解CIA 大鼠的關節腫脹情況。但是，芍甘附子湯是直接還是間接降低IL1RAP 的水平從而調控IL-1β信號通路，仍需進一步研究。

Ctsl 在多種疾病中都有重要作用，可通過調節T 細胞的轉化改善炎癥情況，還可促進關節軟骨中基質的下調，從而促進疾病的發展[14-15]。多項研究表明Ctsl 與RA 相關，通過靶向抑制Ctsl的產生可有效降低RA 關節軟骨侵蝕[16]，Ctsl 缺失的AIA（antigen-induced arthritis）小鼠較野生型AIA 小鼠關節腫脹顯著好轉[17]。本研究中，芍甘附子湯干預組Ctsl 表達下調，提示芍甘附子湯可能通過抑制Ctsl 的產生而改善RA 的病變。

ABHD5 具有溶血磷脂酸酰基轉移酶活性，可催化溶血磷脂酸（LPA）轉化為磷脂酸（PA）[18]。LPA 不僅參與脂質代謝，還是一種重要的脂質信號分子，參與細胞分化、凋亡等過程。在RA 患者中，LPA 還可促進成纖維細胞的增殖，加重炎癥反應，促進RA 的發展。研究表明，RA 患者滑液中LPA 含量明顯升高。多項實驗顯示，LPA 可通過與G 蛋白偶聯受體結合，介導p38/ERK-MAPK信號通路，參與RA 的發生發展[19-20]。本研究表明，芍甘附子湯可能通過上調ABHD5，增加LPA向PA 的轉化過程，進而下調LPA 的含量，緩解CIA 大鼠炎癥反應。

Apelin 信號通路與RA 相關，該通路中核呼吸因子（nuclear respiratory factor 1，Nrfl）的上游因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）為線粒體生物發生的關鍵因子。尚未有研究表明線粒體生物發生與RA的關系，但線粒體生物發生受到抑制會增加骨關節炎的代謝紊亂和炎癥，而促進線粒體生物發生可以治療關節疾病[21-22]。也有研究表明，白藜蘆醇可通過轉錄調控減少炎癥相關基因的表達，并推測Nrf1 和GA 結合蛋白α亞基（GABPA）作為下調基因與白藜蘆醇減輕炎癥有關。因此，需要進一步研究芍甘附子湯干預RA 作用與抑制Apelin 信號通路及下調Nrf1 表達的關系。

研究表明，RA 發作期間TGF-β信號通路被激活，TGF-β1、Smad2 和Smad3 的表達增加，抑制TGF-β信號通路可降低白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平達到治療RA 的目的[23]。E2F 轉錄因子4（E2f4）為Smad2 和Smad3的下游因子。本研究顯示，經芍甘附子湯干預后，E2f4 的表達出現上調，其具體原因有待進一步分析。

綜上，芍甘附子湯干預后，CIA 大鼠共有49個蛋白表達出現顯著變化，其治療RA 作用可能主要與下調IL1RAP、Ctsl，上調Abhd5 的表達有關，但尚需進行實驗證實。