miRNA-22在心肌肥厚大鼠中的表達及對PTEN、SERCA的調控作用

鄧丹

研究心肌肥厚的病理機制，一直都是心血管疾病研究的重點。據報道，心肌肥厚受多種信號通路調節，包括鈣調神經磷酸酶/細胞核因子、轉化生長因子、肌漿網鈣泵(Sarcoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase，SERCA)、磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog)、鈣調神經磷酸酶(Calcineurin，CaN)等，而這些信號通路的促進或抑制作用與微小RNA(microRNA，miRNA)有關[1]。miRNA是一種內源性非編碼的單鏈小RNA，轉錄后對基因表達具有負性調節的作用。文獻顯示，miRNA在心肌細胞生理病理過程中扮演著重要角色[2]。微小RNA-22(microRNA-22,miRNA-22)是miRNA家族中的一員，可通過調控靶基因c-Myc、MYCBP信號通路發揮抑癌作用[3]，能夠增強食管癌細胞放療的敏感性[4]，在癌癥中研究較多。研究顯示，miRNA-22與心肌肥厚有關[5]。凌琳等[6]研究發現，高表達的miRNA-22能夠改善心臟運動能力和收縮功能，抑制心肌細胞纖維化。Xu等[7]研究認為，miRNA-22促進心肌肥大可能與PTEN基因通路有關。Gurha等[8]研究發現敲除miRNA-22的小鼠SERCA活性降低。基于此，本研究采用腹主動脈縮窄術制備心肌肥厚大鼠模型，觀察降低或增加miRNA-22表達對PTEN、SERCA及心肌肥厚相關信號通路蛋白的調控作用，以期為闡明心肌肥厚發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 心肌肥厚大鼠模型的構建 60只雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF級)，體重180～210(194.5±2.3)g，4～6(5.1±0.2)周齡，隨機分為2組，觀察組50只，對照組10只，采用腹主動脈縮窄術構建心肌肥厚大鼠模型。觀察組采用10%的水合氯醛腹腔麻醉，無菌分離腎動脈和腹主動脈，于腎動脈上方約1 cm處，采用5.0型無菌尼龍縫合線將腎動脈與注射針管(外徑0.7 mm)結扎，迅速移除針管。術后每天注射5 U青霉素，持續5 d。對照組處理同觀察組，不做絲線結扎。

1.2 心肌肥厚指標測定

1.2.1 術后7周，采用彩色多普勒超聲診斷儀測定左心室收縮末期左心室內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)和隔舒張末期厚度(IVSTd)。

1.2.2 觀察組50只大鼠隨機分為3組，A組20只，用于miRNA-22轉染；B組20只，用于mi-RNA-22基因敲除；C組10只，用于心肌肥厚大鼠的表征及mi-RNA-22、SERCA、PTEN的測定。

1.2.3 處死C組和對照組大鼠，快速取出心臟，預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，剪掉心臟周圍的組織，濾紙吸干，分離游離臂和室間隔，將左心室稱重，然后見成小塊，每只取2塊采用10%甲醛浸泡，用于組織學檢查；剩余置于凍存管中，液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 HE染色 將甲醛浸泡48 h的組織樣品，采用乙醇脫水，石蠟包埋，旋切機切片后，進行標準的HE染色。然后在顯微鏡下觀察兩組的組織病理學表現。

1.4 miRNA-22、PTEN、SERCA表達測定 取冷凍的心肌組織，Trizol法提取總RNA，檢測濃度和純度。Taqman探針法測定miRNA-22，引物設計和合成由Invitrogen公司進行：逆轉錄反應體系：Taqman探針(10 μmol /L)0.10 μl、rTaq DNA 聚合酶(5 000 kU/L) 0.25 μl、2×Real-time PCR Mix 10 μl、Primer Set(20 μmol/L) 0.40 μl，RNase-free去離子水7.30 μl，逆轉錄產物2.00 μl，總共20 μl。反應條件：90℃/3 min，95℃/12 s，62℃/40 s，共40個循環。采用實時熒光定量PCR法測定miRNA-22的Ct值，miRNA-22的相對表達量以2-△Ct(miRNA-22-內參)表示。

1.4.1 逆轉錄/聚合酶鏈式反應(RT-PCR法)測定PTEN水平：逆轉錄反應體系：引物各10 pmol/L，KCl 50 mmol/L，pH8.4的Tris-HCl 10 mmol/L， sangon Taq DNA聚合酶2.5U， MgCl22 mmol/L，Dntp 0.2 mmol/L，共50 μl。反應條件：93℃/3 min后進入循環， 94℃/45 s，58℃/30 s，72℃/30 s，共35個循環。采用PTC-100熱循環儀擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離。采用分析軟件ScanImage測定條帶密度，采用條帶密度比值(PTEN/NADPH)表示PTEN的相對含量。

1.4.2 逆轉錄/聚合酶鏈式反應(RT-PCR法)測定SERCA水平。3’；SERCA：上游引物5’-TGAATAAACCGCCTCGG-3’，上游引物5’-CAGCACCATCAG CCACT-3’。嚴格按照試劑盒說明書操作。cDNA合成37℃/30min，預變性94℃/2min，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環。最后72℃延伸5 min。采用PTC-100熱循環儀擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離。采用分析軟件ScanImage測定條帶密度，采用條帶密度比值(SERCA/NADPH)表示SERCA的相對含量。

1.5 miRNA-22轉染 A組20只大鼠，心肌肥厚模型構建成功后，在心肌肥厚區域均勻分5點，注射表達microRNA-22 腺病毒/空載體腺病毒(adeno-miR-22/adeno-null，由Invitrogen公司構建并證實轉染效率)，病毒量約為0.1 ml(2×1012viral particles/L)。病毒轉染后常規飼養4周。處死，取心臟組織測定miRNA-22、PTEN、SERCA表達情況。

1.6 基因敲除 B組20只大鼠，心肌肥厚模型構建成功后，進行miRNA-22基因敲除，然后常規飼養4周。處死，取心臟組織測定miRNA-22、PTEN、SERCA表達情況。

1.7 Western blot檢測心肌CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表達 取A組、B組和C組冷凍的心肌組織，采用western blot測定CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表達水平。

2 結果

2.1 心肌肥厚大鼠組織學表現 顯微鏡下可見觀察組心肌細胞直徑增大。見圖1。

圖1 2組造模后大鼠心肌細胞HE染色圖(×400)；A 對照組；B 觀察組

2.2 觀察組與對照組心肌指標比價 C組全心質量、左心室質量、LVDd、IVSTd、LVESD、LVPWTd高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，表明心肌肥厚大鼠造模成功。見表1。

表1 2組大鼠心肌指標比較

2.3 2組大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表達比較 C組miRNA-22表達高于對照組，PTEN、SERCA表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表達比較

2.4 上調miRNA-22對心肌肥厚大鼠PTEN、SERCA表達的影響 A組miRNA-22表達高于C組(P<0.05)，miRNA-22表達顯著上調。A組PTEN、SERCA低于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表達比較

2.5 下調miRNA-22對心肌肥厚大鼠PTEN、SERCA表達的影響 B組miRNA-22表達低于C組(P<0.05)，miRNA-22表達顯著下調。B組PTEN、SERCA高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表達比較

2.6 miRNA-22表達變化對CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表達的影響 3組大鼠心肌細胞CaN、ANP、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，組間兩兩比較顯示，CaN、CaMKⅡ比較A組>C組>B組； SERCA2a比較A組

表5 3組大鼠CaN、ANP、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表達水平比較

3 討論

心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素，也是心功能衰竭的病理基礎。抑制心肌肥厚有助于心血管疾病的疾病的防治，降低發病率和死亡率[9]。研究顯示，miRNA在心肌肥厚中扮演著重要角色[10]。龐志宇等[11]研究發現，共16種miRNA在心肌肥厚大鼠心肌組織中異常表達，其中包含miRNA-22。動物實驗顯示，miRNA-22心臟過表達是引起心肌肥厚的重要原因[12]，但相關機制研究報道較少。

miRNA-22在卵巢癌、食管鱗狀細胞癌、肺癌中特異性表達，廣泛參與癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程[13]。吳德佩[14]發現miRNA-22靶向PTEN/AKT/mTOR信號通路調控自噬及糖尿病腎病腎間質纖維化。隨著研究的深入，人們發現miRNA-22與心臟疾病有關，在主動脈弓縮窄壓力負荷模型中，microRNA-22(-/-)小鼠心臟擴張加劇、收縮功能失代償嚴重，同時伴有心肌纖維化。凌琳等[6]認為心肌梗死后高表達的miRNA-22能夠改善心肌結構和運動能力，減輕心肌纖維化。本研究采用腹主動脈狹窄術制備壓力超負荷心肌肥厚動物模型心肌miRNA-22高表達，與前人[15]研究結果一致。生物學信息顯示，miRNA-22通過結合T管生物起源關鍵蛋白的基因3’UTR的保守集合序列影響T管的發育，且葛根素會影響miRNA-22的表達，具體機制尚不明確。因此，miRNA-22在心肌肥厚大鼠中高表達的原因有待于進一步研究。

CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白是心肌肥厚發病中的關鍵因子，其水平的高低顯著影響心肌肥厚的疾病進展。本研究觀察發現，miRNA-22(+/-)顯著影響CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白的表達，miRNA-22表達上調的心肌細胞CaN、CaMKⅡ表達上調，SERCA2a表達下調，反之亦然。鈣/鈣調蛋白激酶/鈣調神經磷酸酶(Ca/CaMK/CaN)途徑是調控心肌肥厚發病的重要信號通路之一，CaN、CaMKⅡ是該信號通路中的重要蛋白。在該信號通路調控中，隨著鈣離子內流導致細胞內鈣離子濃度升高，從而激活鈣調蛋白激酶II(CaMKⅡ)、CaN，導致CaN 、CaMKⅡ活性和表達量增加，促進心肌肥大[16]。SERCA2a則是一種大分子跨膜蛋白，在心肌肥大時發揮維持胞漿鈣穩態的作用。已有研究[17]顯示，SERCA2a 在終末期心力衰竭患者心臟中表達下調，且與心臟收縮和舒張功能有關。研究顯示，心力衰竭、心肌肥大者SERCA2a在mRNA和蛋白水平方面均下調，導致胞漿對鈣離子的吸收和攝取減慢，進而影響心肌舒張和收縮能力，并通過激活鈣相關通路，促進心肌肥大[18]。

miRNA-22是具有調控作用點作用的非編碼RNA，本研究結果顯示miRNA-22心臟過表達會引起心肌肥厚，具體機制不明。李國然等[19]采用TargetScan等工具預測，SIRT1、PTEN、NAT5、HDAC4 和SRF可能是miRNA-22調控心肌肥厚的潛在靶基因。亦有研究指出，miRNA-22可通過影響SR鈣操縱蛋白參與心肌肥厚進展[20]。本研究觀察miRNA-22(+/-)對PTEN、SERCA基因通路的影響，結果顯示，心肌肥厚大鼠miRNA-22表達上調，PTENmRNA、SERCAmRNA表達下調，呈負性關系。繼續上調心肌肥厚大鼠miRNA-22表達，PTENmRNA、SERCAmRNA表達持續下調，反之PTENmRNA、SERCAmRNA表達增加，提示miRNA-22與PTEN、SERCA基因之間呈負性調節的關系。細胞試驗顯示，下調miRNA-22表達可通過抑制PTEN、SERCA信號通路而抑制心肌肥大[21,22]。PTEN為磷酸酶，在能夠拮抗PI3K，催化PIP3脫磷酸，下調PIP3水平，從而逆轉PI3K對PKB/AKT磷酸化，維持胞漿鈣穩定。當miRNA-22表達上調，通過特異性作用于靶基因PTEN，PTEN表達下降，PI3K對PKB/AKT磷酸化作用增強，鈣離子內流，胞漿鈣濃度升高，Ca/CaMK/CaN信號通路激活，因而CaN、CaMKⅡ蛋白表達上調。SERCA是影響鈣離子內流的另一信號通路，Gurha等[8]發現基因敲除小鼠SERCA活性及表達量降低，SR鈣儲存量減少。分析認為，miRNA-22上調抑制富嘌呤元素相關蛋白PURB的表達，使得抑制狀態的SRF持續抑制，SRF與SERCA結合減少，導致SERCA基因及SERCA2a蛋白的表達降低。隨著SERCA表達的持續減少，胞漿鈣增多，相應 CaN、CaMKⅡ蛋白表達上調。

綜上所述，miRNA-22在心肌肥厚中高表達，上調miRNA-22能夠增加心肌細胞CaN、CaMKⅡ蛋白表達、降低SERCA2a表達，從而促進心肌肥厚，可能與抑制PTEN、SERCA基因通路有關。