miR-133b通過介導TGF-βR1表達下調對食管癌細胞侵襲、遷移的抑制作用

米衛國，張 偉，劉建軍，張昭鵬，楊 帆

陜西省漢中市中心醫院胸外科,陜西漢中 723000

食管癌是全球常見的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內發病率居第7位，病死率居第6位[1]。晚期食管癌患者遠處轉移是其預后不良和高病死率的主要原因[2-3]。微小RNA(miRNA)是一種具有調節作用的非編碼小RNA，通過靶向調節基因表達水平，在癌癥的發生、發展和轉移中起著重要的作用[4]。有研究報道，miR-133b的表達水平和食管癌的病理分級及預后密切相關[5-6]，與食管癌的惡性進展密切相關。轉化生長因子-β受體1(TGF-βR1)是miR-133b的靶基因之一，是轉化生長因子-β(TGF-β)/SMAD3信號通路的關鍵蛋白，TGF-β/SMAD3信號通路激活[7-8]在誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT)，促進腫瘤細胞侵襲和遷移中發揮重要作用[9]。但關于食管癌中miR-133b是否通過調控其靶基因TGF-βR1激活TGF-β/SMAD3信號通路，促進食管癌的侵襲和遷移的研究鮮見報道。因此，本研究擬明確miR-133b通過調控其靶基因TGF-βR1發揮對食管癌侵襲和遷移的作用及機制，為進一步探討miR-133b作為治療食管癌侵襲和遷移的作用靶點提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料來源 人食管癌OE19、ECA109細胞，人正常食管上皮細胞(HEEC細胞)均購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；胎牛血清、RPMI1640細胞培養基購自Hyclone公司；Opti-MEM細胞培養基購自Gibco公司；抗菌藥物(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶均購自中國Solarbio公司；兔抗TGF-βR1抗體、兔抗SMAD3抗體均購自Cell Signaling Technology公司；兔抗p-SMAD3、兔抗E-cadherin、兔抗N-cadherin、兔抗β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自Bioworld Technology公司；RNA提取試劑盒、Trizol、蛋白提取裂解液均購自碧云天生物科技有限公司；miR-133b mimic、miR-133b negative control(miR-133b NC)、WT-TGF-βR1、MUT-TGF-βR1熒光素酶報告基因載體均購自上海吉瑪公司；Lipofectamine(R) 3000購自ThermoFisher公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒(RG027)購自碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人食管癌OE19、ECA109細胞和HEEC細胞，均采用無菌且含10%胎牛血清和1%抗菌藥物(青霉素、鏈霉素)的RPMI1640培養液在37 ℃、5%CO2的無菌細胞培養箱中培養。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測方法 收集對數生長期的人食管癌OE19和ECA109細胞，以HEEC細胞為對照。采用RNA提取試劑盒提取RNA：加入Trizol裂解液，勻漿，加氯仿，室溫5 min，離心，轉移上層水相，加異丙醇，室溫10 min，離心，去上清液，加75%乙醇振蕩混合，4 ℃離心，去上清液，EP管放置干燥，加入焦碳酸二乙酯水充分溶解RNA；采用qPCR檢測RNA濃度；引物序列設計見表1，反轉錄合成cDNA，PCR反應(PCR反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s)檢測miR-133b基因水平，基因的相對表達水平以2-ΔΔCt計算。引物序列由上海吉瑪公司合成并鑒定，見表1。

表1 PCR試驗引物序列

1.2.3細胞轉染 轉染前24 h，將食管癌OE19、ECA109細胞以1×106個/孔的密度接種到6孔板中。次日，冰浴上吸取miR-133b mimic和miR-133b NC各6 μg，用預冷的無血清Opti-MEM培養基250 μL分別稀釋，輕輕混勻后，在室溫無菌臺中靜置5 min。同時吸取Lipofectamine(R) 3000轉染試劑8 μL，用預冷的無血清Opti-MEM培養基250 μL稀釋，輕輕混勻后，在室溫無菌臺中靜置5 min。5 min后，分別混合Lipofectamine(R) 3000轉染試劑、miR-133b mimic和miR-133b NC的稀釋液，每份500 μL，輕輕混勻，室溫無菌臺上靜置20 min。6孔板中細胞用無血清Opti-MEM培養基漂洗2次，每孔加入混合液500 μL。置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育6 h，然后更換含10%胎牛血清和1%抗菌藥物(青霉素、鏈霉素)的RPMI1640培養液，繼續培養48 h，用于后續實驗。

1.2.4Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 遷移實驗：取對數生長期的人食管癌OE19、ECA109細胞和轉染了miR-133b mimic(過表達miR-133b，OE miR-133b)、miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109細胞，調整細胞密度，吸取0.2 mL細胞懸液接種于24孔板的Transwell小室中，使細胞密度為4×104個/孔，小室下層相應加入含30%胎牛血清培養液600 μL，將Transwell小室置于孵箱中培養。培養24 h后棄掉Transwell小室內外液體，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，然后每孔加入4%多聚甲醛1 mL，在室溫條件下固定10 min。棄去多聚甲醛，用PBS洗滌3次。之后在Transwell小室孔中加入0.1%結晶紫1 mL，室溫條件下染色10 min。用PBS洗滌3次，棉簽擦掉Transwell上室中未遷移的細胞。然后將小室置于顯微鏡下拍照，隨后在新的24孔板中放置小室，并加入33%冰乙酸800 μL進行脫色，振蕩5 min使之充分溶解。用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長下讀取吸光度值(A570)，觀察細胞的遷移能力。

侵襲實驗：用無血清的4 ℃預冷細胞培養液在冰浴上稀釋Matrigel膠。稀釋比例為培養基∶基質膠=9∶1；取100 μL稀釋的基質膠加到Transwell上室中，置于37 ℃孵箱中孵育2 h，使基質膠充分膠凝。以下步驟同遷移實驗。用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長下讀取A570，觀察細胞的侵襲能力。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測蛋白水平 收集對數生長期的人食管癌OE19、ECA109細胞，收集轉染了miR-133b mimic和miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109細胞，每組收集的細胞加入蛋白裂解液220 μL，置冰浴上30 min提取細胞蛋白。以13 000 r/min低溫高速離心20 min，棄去細胞沉淀，收集上清液。用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。以40 μg蛋白量作為上樣量，在6%濃縮膠、12%分離膠上進行SDS-PAGE電泳。濕法進行電轉移，將電泳分離后的蛋白轉移至NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1.5 h，按照常規滴加一抗(TGF-βR1、SMAD3、p-SMAD3、E-cadherin、N-cadherin、β-actin，1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日常溫復溫1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，每次5 min。加山羊抗兔二抗(1∶8 000稀釋)，室溫下孵育1.5 h。然后用PBST洗膜3次，每次5 min。最后在化學發光儀中顯影，灰度掃描，以β-actin為內參。結果與β-actin比值做統計分析，檢測TGF-βR1、SMAD3、p-SMAD3、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。

1.2.6雙熒光素酶報告基因試驗檢測miR-133b對TGF-βR1的靶向調控 通過TargetScan數據庫(http://www.targetscan.org)和miRPathDB數據庫(https://mpd.bioinf.uni-sb.de/mirnas.html)檢索，分析發現TGF-βR1的3′UTR區域可與miR-133b結合。通過上海吉瑪基因有限公司構建野生型(WT)和突變型(MUT)基因靶點TGF-βR1的3′UTR熒光素酶報告基因載體(WT-TGF-βR1和MUT-TGF-βR1)。取對數生長期的人食管癌OE19、ECA109細胞接種于24孔板中，使細胞密度為5×104個/孔。采用Lipofectamine(R)3000轉染試劑共轉染WT-TGF-βR1、MUT-TGF-βR1和miR-133b NC、miR-133b，共轉染36 h后，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒，嚴格按照說明書要求，檢測螢火蟲熒光素酶反應強度和內參海腎熒光素酶反應強度，計算2組數據比值進行統計學分析，觀察miR-133b對TGF-βR1的靶向調控，實驗重復3次。

2 結 果

2.1miR-133b在人食管癌OE19、ECA109細胞和HEEC細胞中的相對表達水平比較 結果顯示，miR-133b在HEEC細胞中的相對表達水平為1.08±0.09，在人食管癌OE19、ECA109細胞中的相對表達水平分別為0.61±0.06、0.53±0.08，與HEEC細胞比較，人食管癌OE19、ECA109細胞中miR-133b的相對表達水平明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.2成功構建了過表達miR-133b的人食管癌OE19、ECA109細胞 采用miR-133b mimic和miR-133b NC，應用Lipofectamine(R) 3000轉染試劑轉染人食管癌OE19、ECA109細胞，qPCR檢測轉染細胞中miR-133b的相對表達水平。結果顯示，轉染細胞培養48 h后，轉染miR-133b NC、miR-133b mimic的HECC細胞中miR-133b的相對表達水平分別為1.03±0.06和0.97±0.06，而轉染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109細胞中miR-133b的相對表達水平分別為2.57±0.12和2.33±0.13，與HEEC細胞比較，轉染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109細胞中miR-133b的相對表達水平上調(P<0.01)，表明過表達miR-133b的人食管癌OE19、ECA109細胞構建成功。

2.3miR-133b對人食管癌OE19、ECA109細胞的遷移和侵襲能力的影響 結果顯示，與未轉染的人食管癌OE19、ECA109細胞和轉染miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109細胞比較，轉染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109細胞的遷移和侵襲能力均降低(P<0.01)，見圖1、2。

注：與未轉染和轉染miR-133b NC的比較，*P<0.01。

注：與未轉染和轉染miR-133b NC比較，*P<0.01。

2.4miR-133b對人食管癌OE19、ECA109細胞中TGF-βR1/SMAD3信號通路蛋白表達水平的影響 結果顯示，與未轉染和轉染miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109細胞比較，轉染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109細胞中的TGF-βR1、p-SMAD3、N-cadherin的蛋白水平下降，E-cadherin的蛋白水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

注：A為Western blot檢測各蛋白水平；B為各蛋白相對表達水平。與對照比較，*P<0.01。

2.5miR-133b靶向調控TGF-βR1的表達 通過雙熒光素酶報告基因試驗檢測發現，轉染WT-TGF-βR1基因表達載體后，與轉染miR-133b NC比較，轉染miR-133b mimic的WT-TGF-βR1食管癌細胞的相對熒光素酶活性降低(P<0.01)；轉染MUT-TGF-βR1基因表達載體后，與轉染miR-133b NC比較，轉染miR-133b mimic的MUT-TGF-βR1食管癌細胞的相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

注：*P<0.01，#P>0.05。

3 討 論

食管癌發生轉移是其預后差、病死率高的主要原因[10]，晚期食管癌轉移患者臨床治療多采用化療及放化療結合的方法，但由于放療的耐受性和藥物選擇性低等問題，其預后不佳，嚴重影響食管癌患者生活質量，因此迫切需要對調控食管癌發生轉移的靶點進行研究[11-12]。

miR-133b在多種腫瘤中發揮重要作用[13]，其在食管癌中的表達低于其癌旁組織，與食管癌的發生、發展密切相關，是治療食管癌轉移的潛在靶標[14]。TGF-βR1是miR-133b的靶基因，miR-133b通過靶向結合TGF-βR1的3′UTR端，負調控TGF-βR1的表達[8]；有研究報道，miR-133b通過調控其靶基因TGF-βR1影響腺癌骨轉移及乳腺癌EMT的發生[7-8]。TGF-βR1在誘導食管癌細胞發生EMT，促進食管癌細胞發生侵襲和遷移過程中發揮重要作用[15]，TGF-βR1通過激活TGF-β/SMAD3信號通路，促進SMAD3發生磷酸化。磷酸化SMAD3入核后啟動轉錄翻譯，影響目的基因表達，介導腫瘤細胞EMT的發生[9-10]。而在EMT發生、發展過程中，E-cadherin、N-cadherin是標志物蛋白，E-cadherin表達減少，N-cadherin表達升高，減少細胞間黏附力，進而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[16-17]。

本研究通過qPCR檢測HECC細胞和食管癌OE19和ECA109細胞中miR-133b的表達水平，結果發現，miR-133b在食管癌細胞中的表達水平明顯低于HEEC細胞。通過miR-133b mimic轉染食管癌OE19和ECA109細胞，成功構建過表達miR-133b的食管癌OE19和ECA109細胞，以miR-133b NC為對照組，采用Transwell小室實驗觀察過表達miR-133b的食管癌OE19和ECA109細胞，結果發現，與miR-133b NC比較，過表達miR-133b的食管癌OE19和ECA109細胞的侵襲和遷移能力明顯下降(圖1、2，P<0.01)，表明miR-133b負調控食管癌細胞的轉移能力。進一步機制研究表明，miR-133b靶蛋白TGF-βR1的水平在過表達miR-133b的食管癌OE19和ECA109細胞中明顯下調，TGF-βR1/SMAD3信號通路中SMAD3的磷酸化水平明顯下降，N-cadherin蛋白水平明顯升高，E-cadherin蛋白水平明顯降低(圖3)。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，TGF-βR1的3′UTR區域可與miR-133b結合，miR-133b靶向調控TGF-βR1的表達。

綜上所述，miR-133b在食管癌OE19和ECA109細胞中水平明顯下調，可顯著抑制食管癌細胞的侵襲和遷移能力，其作用機制是通過負調控其靶基因TGF-βR1的蛋白水平，抑制TGF-βR1/SMAD3信號通路活化，進而抑制食管癌細胞EMT的發生而降低其侵襲和遷移的能力。本實驗結果將為miR-133b作為食管癌分子標志物的治療應用提供一定的科學依據。