某實驗室參加食品檢驗用克羅諾桿菌屬標準（樣）品協作標定結果與分析

孫葳

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110036）

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）原名阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）屬,為腸桿菌屬的一個種，革蘭氏陰性桿菌，細胞大小為（0.6～ 1.1）μm×（1.2～3.0）μm，無芽孢，兼性厭氧，通過周生鞭毛運動。該菌屬細胞外有一層便于吸附于物體表面的生物膜，且具有一定的耐干燥和耐熱性，因此該菌分布較廣泛，是食品尤其是嬰幼兒食品中非常重要的條件致病菌之一[1]，其在特定條件下會引起人和動物致病，在嬰幼兒米粉、面條等食品中均有檢出的記錄。我司作為協作標定實驗室之一參加此次食品檢驗用克羅諾桿菌屬標準（樣）品協作標定工作，對含量水平進行考察的同時也提高了實驗室的檢測能力，現結合多年食品微生物檢驗經驗分析此次協作標定工作，以期為食品微生物定量檢驗工作提供參考。

1 實驗材料

1.1 樣品來源

中國食品藥品檢定研究院發放的編號分別為CODE 1 至CODE 10 的球狀西林瓶裝樣品（2018 年）。

1.2 設備和材料

冰箱：2℃～5℃；

恒溫培養箱：36℃±1℃，42℃±1℃；

振蕩器；

電子天平：感量0.1 g；

無菌培養皿；

無菌1.5 mL 的EP 管；

生化鑒定試劑盒；

微量移液器及吸頭。

1.3 培養基及試劑

北京陸橋技術有限責任公司：TSA 瓊脂平板；

法國bioMeriewx.sa：氧化酶試劑、API 20E。

2 定量檢測方法

2.1 樣品的前處理

每件標準品中克羅諾桿菌屬菌的含量約在103CFU/球水平，為保證測試的效果第一稀釋度測定（原液）：將樣品加入到1.5 mL 的EP 管（內含1 mL 無菌生理鹽水）中，使用渦旋振蕩器充分混勻（為保證振蕩的效果，至少渦旋6 次，每次渦旋后將1.5 mL 的EP 管倒過來，彈EP 管底部，將底部的溶液彈起，然后再振蕩）。

第二稀釋度測定（1：10）：取100 μL 原液，加入900 μL 無菌生理鹽水中，混勻制成1：10 稀釋液。

2.2 培養

分別取100 μL 上述稀釋液，加入到TSA 瓊脂平板上，（為保證吸收效果，需要對TSA 瓊脂進行除濕，防止瓊脂表面有過多的水分影響計數效果）每個稀釋度需要平行做2 份，使用L棒涂布均勻至吸收，于36℃培養48 h。

表1 典型菌落計數結果

2.3 菌落計數

取出平板后，參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落計數檢驗》選擇合適的稀釋度進行計數，菌落數在30 CFU～300 CFU 之間的平板。計數結果如表1 所示。

菌落形態：樣品CODE 1 至CODE 10 TSA 瓊脂平板上，菌落均為黃色、濕潤、中等偏大、圓形、形態均一。

氧化酶試驗均為陰性。

2.4 確證試驗（鑒定）

每件樣品，挑取一個典型的克羅諾桿菌的菌落進行生化鑒定。通過API 20E 鑒定試劑盒對CODE 1 至CODE 10 的樣品的可疑菌落進行鑒定，API 20E 生化鑒定結果如表2、表3 所示。

3 結果與分析

3.1 結果

CODE 1 計數結果為3600 CFU/ 球；CODE 2 計數結果為3600 CFU/ 球；CODE 3 計數結果為3700 CFU/ 球；CODE 4 計數結果為4000 CFU/ 球；CODE 5 計數結果為4200 CFU/球；CODE 6 計數結果為4000 CFU/球；CODE 7 計數結果為4400 CFU/ 球；CODE 8 計數結果為3900 CFU/球；CODE 9 計數結果為3900 CFU/球；CODE 10 計數結果為3900 CFU/球。

表2 CODE 2、CODE 3、CODE 7 的API 20E 生化鑒定結果

表3 CODE 1、CODE 4、CODE 5、CODE 6、CODE 8、CODE 9、CODE 10 的API 20E 生化鑒定結果

3.2 分析與討論

3.2.1 關鍵點

此次協作標定為定量項目，西林瓶中的樣品是一個不可分割的整體［2］，應全部用于檢測。關于稀釋度的選擇，因已知每件標準品中克羅諾桿菌屬菌的含量約在103CFU/球水平，故選擇第一稀釋度（原液）和第二稀釋度（1：10）即可。EP管渦旋要至少6 次以上，以確保充分混勻。在用渦旋振蕩器渦旋時要注意，每次渦旋后要將EP 管倒置，將底部液體彈起后再次進行均質。

由于此次協作標定為克羅諾桿菌屬定量檢驗，所用方法為平板涂布法，在涂布前應避免TSA 平板表面有過多水分造成菌落蔓延，進而影響后期菌落的計數。本次所選TSA 平板為商品化即用型平板，日常是保存在4℃冷藏冰箱,在使用前要注意提前從冰箱中取出，可放入培養箱中烘干表面水分后使用。

目標菌在TSA瓊脂平板上菌落形態為黃色、濕潤、中等偏大、圓形、形態均一的菌落，選取菌落數在30 CFU～300 CFU 的平板進行計數。

3.2.2 質量控制[3]

檢驗所使用的培養基、生化試劑等必須在有效期內并經質控驗證合格。某些進口培養基和國產培養基在檢驗時可能會出現不一致的現象，實驗室應做好比對和分析。嚴格且正規的無菌操作在實驗過程中是最基本的要求，否則有雜菌混入必然會影響結果的準確性。

4 結束語

綜上所述，在進行食品檢驗用克羅諾桿菌屬定量檢驗過程中，稀釋度的選擇、液體的均質、涂布及培養基的選擇均可能對實驗結果產生影響，在檢測過程中應重視。同時通過參加此次協作標定，實驗室對菌落的定量檢測能力得到了提高。