克羅恩病患者骨質疏松癥的影響因素分析

鄭鑫輝，崔慧麗，邵 進，孔德策，趙一丁，楊鐵毅

(1.寧夏醫科大學研究生院，寧夏 銀川 750004；2.鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450000；3.上海市浦東新區公利醫院骨科，上海 200135)

克羅恩病（Crohn's disease，CD）是一種慢性炎癥性腸道疾病，以免疫介導和臨床反復發作過程為特征，CD 和潰瘍性結腸炎統稱為炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）[1，2]。CD 病因的確切機制尚不清楚，但有研究認為可能是腸道通透性受損以及自身免疫、環境因素等共同導致的結果[3，4]。糞鈣衛蛋白（fecal calprotectin，FC）可以作為CD 患者腸道嚴重程度的量化指標[5]；zonulin 是調節細胞間緊密連接的調節劑，參與腸道通透性的調節[6]；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是參與CD 病理生理學相關的促炎細胞因子[7]，這些指標對CD 的診斷和治療進展都有深遠的影響。CD 患者有降低BMD 和骨質疏松的風險，據報道[8，9]，CD 和骨質疏松癥存在顯著相關性，且CD 患者發生骨折的風險增加。CD 導致骨密度（bone mineral density，BMD）降低可能機制包括吸收不良和營養不良、限制飲食（低維生素D 和鈣的攝入）、類固醇的使用、低身體質量指數（body mass index，BMI）等[10，11]。然而腸道炎癥過程本身的作用及腸道通透性的作用尚未廣泛研究。骨質疏松癥作為炎性腸病的主要并發癥如何受腸道炎癥影響的發病機制尚不明確。基于此，本研究通過對腸道炎癥指標FC、血清zonulin、血清TNF-α 水平及對腸道組織進行免疫組化和免疫熒光的觀察，探究CD 患者骨質疏松癥可能的影響因素，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1 月～2020 年10 月上海市浦東新區公利醫院診斷的60 例CD 患者設為CD組，納入標準：①符合CD 診斷標準；②年齡≥50歲。排除標準：①伴有內分泌系統疾病以及自身免疫系統疾病、遺傳性相關疾病患者；②肝腎功能異常患者；③就診前服用過影響骨代謝藥物史患者；④傳染病史。另選取同期門診就診的20 例體檢健康人員作為健康對照組。CD 組男28 例，女32 例，年齡51～79 歲，平均年齡61.55 歲；健康對照組男10 例，女10 例，年齡50～73 歲，平均年齡60.09 歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已經通過上海市浦東新區公利醫院臨床醫學研究倫理委員會審批并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMD 檢測 采用美國GE 公司生產的Prodigy型雙能X 線吸收骨密度儀，BMD 值以g/cm2為單位，測定部位為L1～L4腰椎。參照2014 年WHO 制定的骨質疏松癥T 值界定標準：T 值≥-1.0 為骨量正常，T 值-2.5～-1.0 為骨量減少,T 值≤-2.5 判定為骨質疏松。

1.2.2 糞鈣衛蛋白測定 患者于門診就診時直接留取其糞便標本，按照9 ml/g 加0.01 mol/L PBS 進行配比，最終得到糞便質量：PBS 體積為1∶9。在冰上震蕩15 min 后于5000 xg 離心10 min，取上清液進行檢測。根據糞鈣衛蛋白試劑盒（華美生物，武漢）說明書中實驗步驟，測定其含量。

1.2.3 血清zonulin、炎性因子測定 早晨空腹抽取受試者外周肘靜脈血，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定zonulin、TNF-α 水平。根據zonulin 蛋白試劑盒（華美生物，武漢）、TNF-α 試劑盒（上海恒遠生物，上海）說明書中實驗步驟，在涂有特定單克隆抗體的96 孔板中添加標準液和測試血清，室溫孵育1 h 后，將板子在緩沖液中漂洗后加入相應二抗，室溫孵育45 min，再次漂洗后加入配置好的顯色液，使用酶標儀（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）測量各孔的吸光度，對照標準曲線，計算相應含量[12]。

1.2.4 組織取材及ZO-1 表達檢測 在持續心電監護狀態下分別使用電子腸鏡及活檢鉗留取受試者結腸組織標本，大小為2 mm×3 mm。組織標本置于40 g/L多聚甲醛溶液（pH 7.4）中，放置4 ℃固定24 h，常規脫水、透明、浸潤，利用石蠟包埋后，使用組織切片機進行切片處理，每個切片片厚4 μm。放到干燥箱內烘烤，設置溫度為80 ℃。脫蠟、脫水，利用H2O2去離子水消除內源性過氧化物酶活性，然后利用枸櫞酸鈉緩沖液在高溫高壓下抗原修8 min，再用PBS 洗滌。滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液（抗ZO-1 抗體，購自Abcam 公司，1∶800 稀釋），4 ℃環境下放置一夜。在常規溫度下進行復溫處理，PBS 洗滌5 次。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（羊抗鼠IgG，購自博奧森公司，1∶800 稀釋），孵育40 min，PBS 洗滌3 遍。一方面免疫組化DAB 顯色、蘇木精復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，OlympusIX51 顯微鏡下觀察腸粘膜組化免疫顯色情況；另一方面免疫熒光滴加二抗（綠）（羊抗鼠IgG，購自博奧森公司，1∶1000 稀釋），室溫孵育3 h，PBS洗3 遍，Hochest 染色液5 min，PBS 洗3 遍，甘油封片，Olympus IX51 顯微鏡下觀察ZO-1 的表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析。計量資料呈正態分布且方差齊性采用t檢驗，呈正態分布但方差不齊采用校正t檢驗，均以（）表示；不符合正態分布，則采用Wilcoxon 秩和檢驗，以[M（P25，P75）]表示。計數資料采用χ2檢驗，以[n（%）]表示。線性相關分析采用Spearman 秩相關，相關系數以r表示。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較 CD 組BMD 低于對照組，FC、血清zonulin、TNF-α 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 CD 患者BMD 與血清zonulin、FC、TNF-α 相關性分析 Spearman 相關分析顯示，BMD 與FC、血清zonulin、TNF-α 均呈負相關（P＜0.05），見表2。

表1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較[，M（P25，P75）]

表1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較[，M（P25，P75）]

表2 CD 患者BMD 與血清zonulin、FC、TNF-α 相關性分析

2.3 健康對照組和CD 組結腸組織中ZO-1 表達及熒光強度情況比較 免疫組化染色顯示，與健康對照組相比較，CD 組結腸內ZO-1 表達減少、熒光強度減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）；免疫熒光染色顯示，與健康對照組比較，CD 組中黃色顆粒狀物質明顯減少；且健康對照組中有豐富表達典型的網狀蛋白（ZO-1 的網狀染色），CD 組網狀蛋白形態被破壞并且不規則地分布，見圖1。

圖1 健康對照組和CD 組結腸組織中ZO-1 表達及熒光強度情況

3 討論

骨質疏松是一種以骨量下降和骨細微結構破壞為特征的系統性骨病，尤其在中高齡群體常發，是骨折風險的高危因素，已成為CD 患者發病率較高的腸外表現。研究表明[12-14]，CD 患者中骨質疏松癥的診斷率高達19.8%，其主要的危險因素包括腸道炎癥的活動性和嚴重程度、腸道吸收不良導致的鈣、鋅的攝入不足等。因此，減少CD 患者的腸道炎癥程度可能成為治療骨質疏松的必要環節。FC 作為腸道炎癥的敏感標志物，是由炎癥反應中被活化的腸道中性粒細胞分泌，能抵抗酶的降解，一方面其表達水平不僅能夠預測治療效果，還能夠反映腸道粘膜病變的嚴重程度[15]；另一方面，FC 含量與CD 的組織學緩解和粘膜是否愈合具有良好的相關性，而且FC 與CD 的組織學檢查結果（內窺鏡評分）有也很好的相關性[16，17]，因此其可作為監測CD 炎癥活動狀態的輔助措施。

本研究結果發現，CD 組FC 水平較健康組升高，且與BMD 存在負相關（P＜0.05），提示腸道炎癥的嚴重程度可能影響BMD 的水平，進一步驗證了FC 作為CD 診斷的輔助性檢查指標的可靠性[18]。同時，有研究顯示[10]，CD 患者骨質疏松發生率有明顯上升趨勢，表明腸道炎癥與BMD 下降具有相關性，當腸道炎癥的活動性增高時，很可能會導致BMD的下降。但腸道炎癥本身會導致多種有害因素，而這些有害因素與BMD 降低具有一定的相關性，研究表明[19]，CD 患者的BMD 會隨著病情的緩解而有所改善。因此，采用非侵入性且簡單有效的檢查手段量化CD 患者的腸道炎癥的改變，進而通過治療腸道炎癥來減緩骨質疏松的進程，這種方式可能成為未來治療CD 誘導骨質疏松的主要方向。

血清zonulin 升高會通過破壞腸道上皮細胞的緊密連接來影響腸通透性，使緊密蛋白ZO-1 的結構破壞，其濃度的增加與腸道屏障完整性的喪失有關，腸通透性的增加在CD 的發病機制中發揮了核心的作用[20，21]。粘膜屏障的改變會導致腸道通透性增加，從而促進腸腔內物質的暴露，并觸發腸道炎癥的免疫反應，進而導致CD 的發生[22]。既往研究表明[23，24]，在CD 患者中血清zonulin 水平明顯升高。本研究中CD 組血清zonulin 水平高于健康對照組，且與BMD存在負相關（P＜0.05），提示CD 患者的腸通透性受損，使血清zonulin 的表達上調并且腸道屏障的破壞與BMD 下降具有相關性。盡管目前關于血清zonulin 與BMD 關系的研究較少，但有研究表明[25]，腸道屏障功能參與糖皮質激素誘導的骨質疏松癥（GIO），并確定了腸道是預防GIO 的新型治療靶標。因此，腸道通透性的增加可能是CD 誘導骨質疏松的重要條件，通過定量檢測血清zonulin 的水平來觀察腸道通透性的改變，一方面zonulin 水平可能成為CD 的輔助診斷，另一方面其還可以作為CD 誘導骨質疏松的進展評估。ZO-1 是腸道屏障的組成部分，當腸道屏障遭到破壞時，ZO-1 表達及其結構就會遭到破壞[26，27]。本研究中通過腸道活檢發現，CD 患者的腸道免疫組化和免疫熒光結果顯示緊密連接蛋白遭到破壞，進一步驗證了CD 患者的腸通透性受損。這些觀察結果與以下假設相符：增加腸道通透性可能是CD 誘導骨質疏松的重要條件。因此，有必要進行進一步的研究，以評估CD 患者若恢復腸屏障功能能否對骨質疏松的進展起到抑制作用。

CD 患者體內存在著免疫介導的炎癥狀態，其特征是不同炎癥通路的激活和TNF-α 等不同細胞因子的異常分泌，抗TNF-α 是治療CD 的首選生物療法[7]。TNF-α 是破骨細胞形成的主要角色，可通過誘導NF-κB 轉錄的激活，并通過抑制成骨細胞分化減少骨形成，進而導致BMD 改變[28]。因此，TNF-α不僅在CD 的發病機制中發揮核心作用，還參與骨代謝，通過調節破骨細胞活性促進骨吸收。本研究結果顯示，CD 組TNF-α 水平高于健康對照組，且與BMD 存在負相關（P＜0.05），提示腸道炎癥誘導的骨質疏松可能與自身免疫調節異常有關。持續的炎癥或腸道屏障完整性的長期失調會引發或加劇CD，而且炎癥性細胞因子TNF-α 增加通過改變緊密連接功能和結構使上皮通透性增加[29]。因此猜測，腸道炎癥改變、腸道通透性增加和炎癥相關通路三者之間相互影響，共同促進BMD 下降。但由于本研究的樣本少，設計局限，觀察周期短等不足之處，上述猜測需進一步深入研究證實。

綜上所述，FC、血清zonulin 的水平檢測對CD患者腸道炎癥改變和腸道通透性評估具有一定價值，CD 誘導的BMD 改變與腸道炎癥改變、腸道通透性增加及血清TNF-α 具有相關性。但針對炎癥反應的治療仍需進一步探索，以緩解或恢復CD 患者的腸道功能，從而控制骨質疏松。