房顫冷凍球囊消融術對調控編碼超速激活延遲整流鉀通道蛋白的影響

黃 城，姚 娟，燕建鋒，方 舒，宋遷甲

（石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000）

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是最常見的持續性心律不齊，其發病率及死亡率均較高。據統計[1]，約1/3 的正常人有發生房顫的風險，與非房顫患者相比，其死亡風險增加了1.5～3.5 倍，中風風險增加了5 倍，認知功能下降風險增加了1.4～1.6 倍；20%～30%的房顫患者會出現心衰，16%～20%的出現抑郁，超過60%的患者存在生活質量下降，年住院率達10%～40%。目前關于房顫的發病機制尚不清楚，進一步研究房顫的潛在機制可能為房顫的提供新的治療方法[2]。近年來，有關miRNA 對房顫的研究越來越多[3-5]。有人提出了幾種miRNAs 作為房顫的生物標志物，但目前尚無可用于診斷目的[6]。目前關于miRNA 與房顫消融結果的研究較少。其他研究顯示，房顫患者的血漿miR-21 水平較對照組低，導管消融后1 個月miR-21 表達增加[7]。持續性房顫患者接受消融后，循環miR-21 水平也與房顫消融結果相關[8]。基于此，本研究主要觀察房顫患者外周血中miRNAs 的變化情況，探討其對超速激活延遲整流鉀通道的影響，進一步分析房顫可能的基因靶向治療機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月～2019 年10 月新疆維吾爾自治區人民醫院經病史、心電圖或動態心電圖資料明確診斷為房顫，符合冷凍球囊消融術適應癥并接受冷凍球囊消融術后隨訪3 個月無復發患者作為研究對象，共45 例，男35 例，女10 例。將術前全基因組測序作為對照組，術后測序作為試驗組。納入標準：①依據國際通用的診斷標準[9]，房顫的診斷結合既往病史、房顫時癥狀、體征、心電圖或動態心電圖明確；②左室射血分數（LVEF）≥50%。排除標準：①年齡＞75 歲；②合并甲亢，糖尿病，高血壓，左室功能減低（EF＜40%），嚴重冠狀動脈疾病，肝、腎功能障礙，急、慢性感染疾病以及心肌結構性病變。所有患者均給予相同的藥物調節血壓、血脂，停用β-受體阻滯劑和其他抗心律失常藥物。本研究已經新疆維吾爾族自治區人民醫院醫學倫理委員會通過，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料與儀器 Illumina NextSeq 500 測序儀（美國Illumina 公司），anoDrop ND-1000 分光光度計（美國Nanodrop 公司），總RNA 提取試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司），DEPC 處理水（無錫菩禾生物醫藥技術有限公司），氯仿（上海蘇懿化學試劑有限公司20170415），無水乙醇（常熟市鴻盛精細化工有限公司20200910），SYBRGreen PCR 試劑盒（Thermo F -415XL），逆轉錄試劑盒（Thermo#K1622），紅細胞裂解液（無錫菩禾生物醫藥技術有限公司），低溫冷凍離心機（eppendorf 德國艾本德股份公司5417R），Real-time 檢測儀（ThermoFisher Scientific 賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司ABI-7500）。

1.2.2 實驗步驟 分別抽取試驗組、對照組清晨空腹外周靜脈血4 ml，置于EDTA 抗凝管中，2 h 內分離血漿，離心后吸取上清液置凍存管中，-80 ℃冰箱保存。提取總RNA 均采用標準試劑盒，經瓊脂糖電泳和Nanodrop 質檢和定量后，構建好文庫，Agient 2100 Bioanalyzr 進行文庫質量測定，混合好的不同樣品的測序文庫，通過0.1 mol/L NaOH 變性生成單鏈DNA 分子，在Iumina flow cell 上捕獲，原位擴增為簇（cluster），根據說明，在Ilumina NextSeq 500 測序儀上進行51 個cycle 測序。測序完成后，使用Solexa CHASTITY 質控篩選原始reads 得到Clean Reads。用cutadapt 以對Clean Reads 去接頭，并留下長度≥15 nt 的tag 得到trimmed reads。利用miRDeep2 軟件使用所有trimmed reads 進行已知miRNA 定量和新miRNA 預測。最后用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應驗證和蛋白定量分析差異表達顯著的基因來確保實驗的準確性。其中，實驗中所有研究對象血液樣品中總RNA 的提取均使用總RNA抽提試劑盒，cDNA 的反轉錄使用逆轉錄試劑盒（Thermo #K1622）。以GAPDH 為內對照基因，采用2-△△CT法計算各組中基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 mcirRNA 水平實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應引物序列

1.3 觀察指標 比較兩組miRNA 表達差異，并通過mirbase、miranda、targetscan3 個數據庫進行靶基因分析，對存在差異的miRNA 進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應和蛋白質印跡法驗證。

1.4 統計學處理 實驗數據錄入Excel 表格，應用SPSS 23.0 軟件包和ABI Prism 7500 SDS Software軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，比較采用t檢驗；計數資料以（n）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miRNA 表達比較 全基因組測序顯示，兩組miRNA 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中has-miR-134-5p 等15 個miRNAs 術后下調，has-miR-1255a 等6 個miRNAs 術后上調，見表2。

2.2 兩組miRNA 靶基因預測 通過設定閾值為1.5倍差異，P≤0.05 且組內CPM 均值≥1 來篩選差異表達的miRNAs，結果顯示，代表KCNA5 的hsamiR-4433b-3p miRNA 與房顫密切相關，術前定量表達的CPM 值為0.741，術后CPM 值為-1.643，術前與術后相比表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 兩組KCNA5 蛋白表達量比較 RT-PCR 結果顯示，試驗組血清中KCNA5 表達水平較對照組下調[（0.398±0.060）vs（1.000±0.035）]，差異有統計學意義（t=15.996，P=0.004）。Western Blot 檢測顯示，與對照組相比，試驗組KCNA5 的表達水平降低，見圖1、圖2。

3 討論

心臟細胞中的超快速延遲整流器（IKur）電流由電壓門控鉀離子通道Kv1.5 介導，它通過影響心房肌細胞動作電位時程（APD）和有效不應期（ERP）影響心房的正常節律和頻率，房顫的發生發展與電壓門控鉀離子通道有著千絲萬縷的關系。而Kv1.5 蛋白由KCNA5 基因編碼，已有研究[10]表明KCNA5 基因單核苷酸多態性rs3741930 位點與特發性房顫（IA）發生風險有關，特發性房顫患者KCNA5 基因通常攜帶C 等位基因。Ni H 等[11]通過使用多尺度機電模型強調了IKur 在調節人心房收縮性中的重要作用，功能獲得性KCNA5 突變對心房收縮力有嚴重損害。王汝朋等[12]發現房顫患者超快激活的延遲整流鉀電流通道表達下調顯著的是KCNA5 基因，較為顯著的更多的是鉀離子通道，預示房顫電重構與鉀離子通道重構有著密切聯系。

表2 兩組miRNA 表達比較

圖1 KCNA5 蛋白表達量條形圖

圖2 KCNA5 蛋白表達的Western Blot 圖

本次研究發現，試驗組患者外周血中miRNA 水平與對照組完全不同，手術可能作為外在因素通過逆轉KCNA5 的電重構，從而影響miRNA 的表達使房顫離子通道離子流失調，提示miRNA 可能通過改變心房細胞的電生理特性而參與了房顫的發病過程。miRNA 是一類保守非編碼分子，長度約為18～25 個核苷酸，它能夠抑制mRNA 翻譯或者沉默目的基因，抑制轉錄后水平上靶基因表達[13]，其原理是通過與其靶基因mRNA 的3' 非翻譯區堿基配對結合。據報道，miR 122、miR-155-5p、miR-24-3p、miR-223 與房顫的進展有關[14，15]。在由miRNA 的致病性上調引起的疾病中，敲除方法（如miRNA 海綿）可用于將上調的致病性miRNA 恢復到正常水平[16]。Lu Y 等[17]采用微陣列分析方法評估了犬模型和房顫患者心房樣本的miRNA 表達譜，通過實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應進行了驗證，結果發現miR-223、miR-328 和miR-664 隨房顫發生顯著上調，而miR-101、miR-320 和miR-499 表達下調。早期研究表明[18]，射頻消融術通過影響房顫患者離子通道蛋白表達，從而促進離子通道電流再平衡，miRNA-1266 等miRNAs 有可能是房顫未來新的干預靶點。本次研究發現，試驗組hsa-miR-4433b-3p 表示上調，RT-PCR 驗證和蛋白定量分析顯示作為調控超速延遲整流鉀通道上動作電位平臺期鉀離子外流的通道蛋白KCNA5 基因表達較對照組增加，鉀離子在平臺期外流增加，而試驗組則相反。考慮房顫的電重構可能與超速延遲整流鉀通道的離子通道蛋白重構和離子流改變有關，冷凍球囊手術改變了房顫的離子通道蛋白重構，使表達調控的miRNAs 增加。Colman MA 等[19]研究明確了KCNA5 基因的6 個新突變，這些突變體同時表現出心房特異性超速延遲整流鉀通道電流的功能獲得和功能喪失，并闡明和量化這些KCNA5 突變對心房電活動的功能影響，與本研究結果一致。

本研究選擇了代表調控超速激活延遲整流鉀通道蛋白miRNA 的KCNA5 基因進行了RT-PCR 驗證，校正用內對照基因（管家基因GAPDH）。兩組表達差異結果與測序結果大致相同，上調或下調的趨勢相同，RT-PCR 驗證與蛋白定量分析結果一致，提示冷凍球囊手術改變了超速延遲整流鉀通道離子流原始平衡狀態，起到了再平衡作用，對調控心臟超速激活延遲整流鉀通道蛋白的miRNA 存在一定影響，提示hsa-miR-4433b-3p 可能為房顫的潛在生物標志物。

綜上所述，冷凍球囊消融術影響了房顫離子流的動態平衡，調控編碼超速激活延遲整流鉀通道蛋白的hsa-miR-4433b-3p 等miRNAs 有可能為房顫新的生物標識物和潛在的治療靶標。