miR-215-5p在甲狀腺濾泡癌中的表達及與血清TSH的相關性*

劉光霞 趙連春 陳芳 牛麗霞 盧亞敏 高偉 侯瞻

(1.河北省人民醫院核醫學科，河北 石家莊 050051；2.河北以嶺醫院檢驗科，河北 石家莊 050091;3.河北省人民醫院檢驗科， 河北 石家莊 050051)

甲狀腺濾泡癌嚴重危害人們健康，病變的形成、進展與多種遺傳物質及細胞因子的改變有關[1]。微小RNA(miRNA)是近年關注到的與腫瘤形成有關的基因，是由19-25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過與目標基因非翻譯區結合，調控細胞的異型增殖[2-3]。本研究應用TCGA、NCBI GEO Data Sets數據庫進行交叉篩選，選取與甲狀腺濾泡癌密切相關、文獻報道鮮少的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)進行研究，分析其在腫瘤中的表達特征，并探討miR-215-5p與促甲狀腺激素(TSH)的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取2014年3月～2017年4月河北省人民醫院和河北以嶺醫院確診為甲狀腺濾泡癌行手術治療的55例患者術后組織為觀察組。納入標準：①均為明確診斷的甲狀腺濾泡癌，并由病理醫師復核切片。②首次確診。③臨床及病理資料齊全。排除標準：①診斷有異議者。②術前行放、化療者。③隨訪資料不全或家屬不同意觀察者。留取術前血清標本及術后組織標本。另選取55例經病理確診為甲狀腺濾泡性腺瘤為對照組。留取術后組織標本。本研究經醫院倫理委員會審核并批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 miR-215-5p檢測 應用實時熒光定量PCR法檢測兩組中miR-215-5p的表達。采用TRIZOL試劑(美國，Invitrogen公司)提取細胞總RNA后，通過逆轉錄實驗合成cDNA(日本，TaKaRa公司)，按照相應qPCR試劑盒說明書檢測miR-215-5p水平。引物由上海碧云天公司合成，miR-215-5p上游引物：5′-GTCAACCATCGCTGCATCCAC-3′；下游引物：5′-GACTGACGACGTCCGTGCCAC3′。以U6為內參，引物上游：5′-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3′下游：5′-TTGGAATACGAATTCCG-3′。擴增反應條件：95 ℃ 8 min。95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個循環。將miR-215-5p的表達針對U6標準化，采用2-△△Ct表示相對水平進行分析。

1.2.2 免疫組化法檢測Ki67的表達 應用免疫組化SP法檢測甲狀腺濾泡癌組織中Ki67的表達。Ki67濃縮液和DAB均購自武漢博士德生物技術公司。基于石蠟包埋組織進行檢測，切取4 μm切片。先按不同比例進行預實驗，選擇預實驗中顯色最理想的濃度(Ki67為1∶200)用于正式實驗。正式實驗均由同一技師操作，DAB顯色。陽性部位是細胞核，選擇5個400倍視野(熱點區)進行觀察，計算陽性率的平均值。Ki67的陽性率亦稱為增殖指數。

1.2.3 電化學發光法檢測血清中TSH的表達 抽取術前患者的空腹靜脈血，4000轉/min離心15 min后，應用電化學發光法檢測血清中TSH的表達。做好質控工作，減少人為誤差。

2 結果

2.1 患者的一般資料 甲狀腺濾泡癌患者共55例，其中男性29例，女性26例；年齡32～78歲，中位年齡57歲；腫瘤最大徑1～7.8 cm，平均(4.2±1.2)cm; TNM分期Ⅰ期32例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例，Ⅳ型2例。對照組共55例，其中男性28例，女性27例；年齡28～75歲，中位年齡56歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。病理形態見圖1。

圖1 病理形態圖(200×)

2.2 兩組miR-215-5p 表達的比較 觀察組miR-215-5p的表達量(1.36±0.09)明顯低于對照組(2.29±0.18)，差異有統計學意義(t=6.57，P=0.002)，見圖2。

2.3 miR-215-5p在不同臨床病理特征分組中表達的比較 miR-215-5p 的表達在不同腫瘤最大徑、Ki67增殖指數和TNM分期的分組中差異有統計學意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡的分組中差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖3。

圖2 miR-215-5p在兩組中表達的比較

表1 miR-215-5p在不同臨床病理特征分組中表達的比較

圖3 Ki67的表達(200×)

2.4 miR-215-5p 表達的生存分析 患者均進行術后3年的隨訪，截止時間點為2020年1月31日。其中，存活39例，死亡9例，失訪7例。死亡患者確診后的生存時間為6～36個月，中位生存期為21個月。以miR-215-5p表達的平均值(1.36)為臨界值行K-M生存分析，顯示miR-215-5p的表達與預后相關(2=5.46，P=0.028)，即miR-215-5p低表達患者的預后差，見圖4。

圖4 miR-215-5p 表達的生存分析

2.5 觀察組miR-215-5p與血清TSH的相關性 電化學發光法檢測到血清中TSH的表達范圍為0.27～4.20 μIU/mL，平均為(3.12±1.16)μIU/mL。相關分析顯示，血清中miR-215-5p 與TSH呈負相關(r=-0.61，P=0.012)，見圖5。

圖5 miR-215-5p與TSH的相關性

3 討論

甲狀腺濾泡癌發生機制涉及多種分子生物學通路，與DNA、RNA及蛋白的表達失調均有關[4]。近年學者認為，P53和細胞增殖是甲狀腺濾泡癌病變形成的經典途徑[5]，并發現其影響因素較多。近年學者關注到miRNAs異常表達對腫瘤的進展有促進作用[6-7]，并發現了多種對甲狀腺異常增殖細胞中有影響的P53和增殖調控的miRNAs[8]。因此，本研究在實驗前進行篩查，選擇miR-215-5p進行實驗研究，同時也發現miR-215-5p異常表達對腫瘤細胞增殖和凋亡有一定的調節作用[9-10]。有資料顯示，miR-215-5p在人體正常的組織和細胞中具有一定的表達量，而在腫瘤性病變中常伴有miR-215-5p表達的下調[11]。miR-215-5p可能作為腫瘤抑制基因發揮作用。miR-215-5p下游基因較多，包括增殖相關基因、轉移相關基因等[12-13]。

本研究結果顯示，甲狀腺濾泡癌中miR-215-5p低表達，提示miR-215-5p低表達對腫瘤的形成有促進作用。miR-215-5p具有抑癌基因樣的作用，通過與下游靶基因的3′UTR結合調控mRNA實現其功能[14-15]。本研究結果亦顯示，miR-215-5p 的表達在不同腫瘤最大徑、Ki67增殖指數的分組中差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-215-5p低表達預示腫瘤處于較高的增殖狀態，腫瘤生長快，對周圍的侵襲性強[16]。從細胞動力學角度分析，正常甲狀腺上皮細胞屬于穩定狀態的細胞群，其細胞增殖和死亡的速度均較低，在腫瘤性因素的刺激下發生明顯增殖，miR-215-5p的異常表達使增殖平衡打亂，正調節和負調節失平衡，細胞增殖旺盛。miR-215-5p是細胞分化等多種生理過程的關鍵調節因子，miR-215-5p介導的復雜而精確的調控網絡機制在維持細胞增殖的動態平衡中具有關鍵作用。有研究顯示，miR-215-5p異常表達可以調控CTCF的翻譯來降低GATA4、NKX2.5和WNT的表達量[8]，這表明miR-215-5p的調控是多元性的，其調控機制復雜。生存分析發現，miR-215-5p的表達與預后有關，提示miR-215-5p可能對判斷預后有一定價值，即miR-215-5p低表達的患者生存時間短，預后差。這與miR-215-5p在不同TNM分期的表達中差異有統計學意義的結論一致。但是miR-215-5p對預后判斷的應用尚需要后續進行多中心、大樣本及多因素分析后進一步明確。本研究發現，甲狀腺濾泡癌組織中miR-215-5p 與血清TSH呈負相關，提示兩者可能具有協同作用，但機制不清楚。由于TSH由垂體分泌，可能與miR-215-5p作為調節內分泌細胞的因子有關[17-18]。也有學者在垂體瘤中發現多種miRNAs表達[19]，這可能是兩者具有關系的機理之一，兩者的關聯性為后續研究miR-215-5p提供了創傷性小及取材容易的方法。

4 結論

miR-215-5p在甲狀腺濾泡癌中的表達下降，其與病變的臨床特征相關，且與TSH呈負相關。miR-215-5p 的表達可能與預后有關。