松仁肽及其Zn2+螯合物的分離純化、結構表征的對比分析1)

孫家佳 杜亞飛 包瑞敏 張智 楊可心 魏罡

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

松仁當中含有豐富的營養物質，其中包括蛋白質、脂肪酸、氨基酸、脂肪、維生素、礦物質元素及其他的生物活性物質[1]，松仁肽是由松仁蛋白在酶的作用下水解得到的小分子肽鏈[2-4]。為了克服松仁蛋白在營養方面的弱點，提供極易消化吸收的多肽化合物，有研究采用微生物法發酵松仁肽，利用微生物通過自身的生理功能將松仁蛋白轉化為小分子的多肽，該法所得到的松仁肽更易于機體吸收，并且成本低，苦味少，為多肽的制備提供了新的參考[5-7]。

鋅是人體所須的營養素，是人體上百種酶的組成元素，參與多種生理功能。鋅對兒童和老人的身體健康十分重要，缺鋅會使嬰幼兒生長發育緩慢、智力發育不良、免疫功能下降等[8-9]。所以，相應的Zn2+在食品方面的研究也越來越受到重視。

肽鋅螯合物是當前普遍研究的新型營養補充劑，螯合的概念是指一分子或兩分子的官能團與金屬離子之間，通過配位作用生成環狀構造的化學反應，螯合作用在食品應用方面具有重要的意義[10-11]，人體攝取一些無機微量金屬元素的消化吸收效率較低，一般在2%～10%，營養物質的利用價值較低。但一些金屬微量元素與氨基酸結合形成螯狀化合物時，人體對其的消化吸收的效率大大提高，是未螯合之前的2～10倍，所以螯合物在食品方面起著重要的作用，對于一些營養物質的吸收，可以提供較好的方式，提高營養的吸收率[12-14]。本研究主要對相同條件下制備得到的松仁肽與其Zn2+螯合物進行分離純化，并以抗氧化能力作為評價標準，進行結構表征的分析與對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松仁粕(市售)；葡聚糖凝膠Sephadex G-50、葡聚糖凝膠Sephadex G-15、DPPH、ABTS，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸(分析純)、濃硫酸(分析純)、三氯化鐵(分析純)、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵，天津市光復精細化工研究所；水楊酸，天津市天力化學試劑有限公司。

YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；JA2003型電子天平，海精科儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱，海一恒科技有限公司；DL-6M離心機，湖南星科科學儀器有限公司。

1.2 松仁肽-鋅螯合物及松仁肽的制備

松仁肽-鋅螯合物的制備：取適量的松仁用粉碎機粉碎，過篩(60目篩子)，將得到的松仁粉末粕經索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液體培養基，加入0.6 g的ZnSO4，用蒸餾水配置成質量分數為12%的懸濁液，枯草芽孢桿菌的接種量為3%，在溫度為36 ℃，160轉/min的搖床中發酵52 h。高溫滅菌后，待冷卻，離心取上層清液，冷凍干燥得到粗制松仁肽-鋅螯合物(備用)。

松仁肽的制備：取適量的松仁用粉碎機粉碎，過篩(60目篩子)，將得到的松仁粉末粕經索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液體培養基，用蒸餾水配置成質量分數為12%的懸濁液，枯草芽孢桿菌的接種量為3%，在溫度為36 ℃，160轉/min的搖床中發酵52 h。高溫滅菌后，待冷卻，離心取上層清液，冷凍干燥得到粗制松仁肽(備用)。

1.3 超濾

將去離子水加熱至50～60 ℃后清洗超濾組件；在原料液儲槽中加入一定量的備用處理后的松仁肽或松仁肽-鋅螯合物后，打開低壓料液泵回流閥和低壓料液泵出口閥，打開超濾料液進口閥、超濾清液出口閥和濃液出口閥，使整個回路通暢。用截留相對分子質量10 000的中空纖維柱低溫過濾。在測量過程中記錄濾前體積、濾后體積，計算濾液回收率。

濾液回收率=(Vi/V)×100%。

式中：Vi為濾后體積(mL)；V為濾前體積(mL)。

1.4 葡聚糖凝膠Sephadex G-50一級分離

選定合適的層析柱型號(1.6 cm×20 cm)，將干膠顆粒倒入燒杯并加入5～10倍量的蒸餾水，加熱溶脹，沸水浴中2～3 h即可使其凝膠充分溶脹。

凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，用去離子水清洗；層析柱循環流淌15 min，與此同時在向裝有葡聚糖凝膠Sephadex G-50中加入1/3容積的洗脫液(去離子水)，用玻璃棒攪拌使其成為懸濁液。將葡聚糖凝膠懸濁液加入已清洗好的層析柱，緩慢加入使其均勻填充[15]。

加樣：用吸管吸去凝膠柱床頂部大部分液體，小心地把經超濾處理后的松仁肽與松仁肽-鋅螯合物加入柱床表面，使其呈一均勻薄層。

洗脫與收集：以蒸餾水為洗脫液，控制流速為0.5 mL/min，樣品質量濃度為20 g/L(用冷凍干燥后的固體樣品配置)，用小型試管收集，每管收集2 mL，于220 nm波長下測定吸光值。

對于出現的吸收峰，進行體外抗氧化能力比較，分別測試清除羥自由基、總還原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4個指標，選出抗氧化能力最強的進行二級分離。

1.5 葡聚糖凝膠Sephadex G-15二級分離

在一級處理的前提下，對經過一級分離后的松仁肽及松仁肽-鋅螯合物進行二級分離，葡聚糖凝膠Sephadex G-15的前處理方式、裝柱及加樣的實驗方式與1.4的實驗方式相同。

1.6 抗氧化指標的測定

羥自由基的測定。H2O2與亞鐵離子生成·OH，·OH自由基具有較高的反應活性，因為存活時間較短，加入水楊酸，會與·OH自由基反應生產紫色絡合物，該有色絡合物在510 nm處有較大的吸收波長，吸光度與·OH自由基的量成正比[16-17]。反應體系中含有9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、9 mmol/L硫酸亞、8.8 mmol/L H2O2。比色管中依次加入硫酸亞鐵、水楊酸、去離子水，最后加入H2O2，搖勻，在37 ℃條件下反應30 min，以蒸餾水歸零，在510 nm的波長下測吸光度[18-19]。

式中：A0為空白對照組的吸光度；AX為加入樣品后的吸光度；AX0為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

還原力的測定。取1 mL不同質量濃度的3種待測樣品溶液，分別與pH為6.6、濃度為0.2 mol/L的2.5 mL的磷酸鈉緩沖液和2.5 mL的鐵氰化鉀混合，在50 ℃保溫30 min后迅速冷卻；再加入2.5 mL三氯乙酸后離心3 000 r/min，10 min后取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液，混合均勻[20]。反應10 min后在700 nm波長下測吸光度，比較3種被測樣品的還原能力，吸光度越大說明還原能力越強[21]。

DPPH自由基清除率的測定。取DPPH 3.5 mg，用無水乙醇溶解，轉入10 mL容量瓶，用無水乙醇定容至刻度。取2 mL至100 mL的容量瓶中，搖勻得濃度為0.017 8 mmol/L DPPH儲備液備用。用乙醇將松仁肽-鋅的螯合物稀釋一定濃度，待測。在10 mL比色管中一次加入4 mL DPPH和螯合物的稀釋液，加入乙醇至刻度，混均勻立即在517 nm的波長下測吸光值[22]記為Ai。將待測液在室溫避光的條件下保存30 min后測吸光值，記為Aj。對照試驗為只加DPPH的乙醇溶液，測吸光值為Ac，按下式計算自由基清除率(K)[23]。

ABTS清除自由基的測定。取0.4 mL ABTS工作液，用PBS溶液稀釋備用，2 mL的ABTS溶液分別與松仁肽、松仁肽-鋅螯合物混合，常溫避光下靜止6 nim，在734 nm波長處測定不同吸收峰的吸光度，并記錄下來，計算清除率。

式中：A0為不加樣品時ABTS溶液的吸光度；A1為加樣品后所測得的吸光度。

1.7 結構表征的測定

氨基酸組成的測定。將純化后的松仁肽與松仁肽-鋅螯合的樣品冷凍干燥后備用，以固體的形式用氨基酸自動分析儀測定氨基酸的組成。

紫外掃描光譜的測定。用去離子水將松仁肽及松仁肽-鋅螯合物分別配制成質量濃度為0.1 mg/mL溶液，采用全自動紫外掃描儀分別進行全波長掃描，掃描范圍200～400 nm，分析小肽進行螯合反應前后其吸光度的變化情況，以去離子水作為空白調零。

傅里葉紅外光譜的測定。分別取肽與肽鋅螯合物固體樣品2 mg及干燥后的KBr 200 mg，放入瑪瑙研缽中混合研磨，研磨至粒度在2.5～2.0 μm，裝入壓片裝置中，加壓至20 MPa，維持1～2 min；取出壓片，呈半透明狀。利用傅里葉變換紅外光譜儀進行定性分析，得到光譜，波長范圍500～4 000 cm-1。

能譜的測定。分別將肽與肽鋅螯合物粉末用雙面膠粘貼于鋁制樣品臺上，然后噴涂一薄層金膜，用能譜儀測定各元素的組成和所占的百分比。

2 結果與分析

2.1 超濾結果

用截留相對分子質量10 000的中空纖維柱低溫過濾、截留后，相對得分子質量10 000左右的濾液。所得松仁肽和松仁肽-鋅螯合物濾液回收率為87.4%和83.7%。

2.2 松仁肽的分離純化

2.2.1 松仁肽Sephadex G-50一級分離結果

利用Sephadex G-50凝膠柱可將松仁肽初分為4個組分，分別命名為P-1、P-2、P-3、P-4，其中P-1、P-2、P-3主要是分子量較大的部分，估計主要由枯草芽孢桿菌產生的蛋白酶及未充分水解的蛋白質組成；P-4主要是水解后的短肽。P-4后還有一部分組分具有吸收值，這部分對應于相對分子質量最小的部分，估計主要是游離氨基酸或小分子鹽類物質，不予保留。由表1可知抗氧化能力最強的部分為P-4，選其進行下一步實驗。

圖1 松仁肽一級分離洗脫曲線

表1 組分P-1、P-2、P-3、P-4抗氧化能力測定結果

2.2.2 松仁肽Sephadex G-15二級分離結果

利用Sephadex G-15可將P-4分成3個組分，分別為P-4-1、P-4-2、P-4-3，烘干后分別配制質量濃度為0.5 mg/mL的各組分溶液，測其抗氧化能力。由表2可知P-4-3的抗氧化活性明顯高于其他組，擇優選取抗氧化能力最強的組分P-4-3進行下一步的結構分析和氨基酸組成分析實驗。

圖2 松仁肽二級分離洗脫曲線

表2 組分P-4-1、P-4-2、P-4-3、抗氧化能力的測定

2.3 松仁肽-鋅螯合物的分離純化

2.3.1松仁肽-鋅螯合物Sephadex G-50一級分離結果

螯合物的洗脫圖3中同樣出現3個吸收峰，分別記作P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3的3個組分。同樣P-Zn-1、P-Zn-2為相對分子質量較大的物質，推測為草芽孢桿菌產生的蛋白酶、未充分水解的蛋白質及其螯合物；P-Zn-3為水解后短肽的螯合物。通過抗氧化能力的比較得出P-Zn-3的抗氧化能力最強，選擇P-Zn-3進行下一步的分離。

圖3 松仁肽-鋅螯合物的一級分離洗脫曲線

表3 組分P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3抗氧化能力的測定

2.3.2松仁肽-鋅螯合物的Sephadex G-15二級分離結果

經過Sephadex G-15的P-Zn-3可得到3個組分，分別為P-Zn-3-1、P-Zn-3-2和P-Zn-3-3，其中P-Zn-3-3表現出較強的抗氧化能力。雖然各組分都是多肽分子，但相對分子質量、結構組成不同及某些氨基酸的位置數量不同均對抗氧化活性有影響，需進一步的實驗驗證。

P-4-1和P-Zn-3-1兩者的4項體外抗氧化指標比較可以得出P-Zn-3-1的抗氧化能力高于P-4-1，因此選擇P-4-1、P-Zn-3-3組分進行下一步的結構分析和氨基酸組成分析試驗。

圖4 松仁肽-鋅螯合物的二級分離洗脫曲線

表4 組分P-Zn-3-1、P-Zn-3-2、P-Zn-3-3抗氧化能力的測定

2.4 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的結構表征對比

2.4.1 氨基酸組成對比

表5為松仁肽與松仁肽-鋅螯合物中氨基酸質量分數比較，可知松仁肽與鋅發生螯合反應后，蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和脯氨酸的質量分數均減少，其他11種氨基酸質量分數均有不同程度的增加。其中天冬氨酸和谷氨酸的質量分數增加幅度較大，天冬氨酸的質量分數由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的質量分數由14.953%上升到16.076%，且這兩種氨基酸在螯合物中所占比例最高。以上分析表明，酸性氨基酸質量分數高的多肽更容易與Zn2+發生螯合反應，同時也說明了酸性氨基酸與Zn2+的結合能力更強。

2.4.2 紫外掃描光譜分析

肽與肽鋅螯合物溶液在200～400 nm波長范圍內的掃描曲線如圖5所示。可以看出，肽與肽鋅螯合物的紫外吸收光譜發生了明顯的改變。肽在220 nm處具有明顯的吸收峰，而與Zn2+螯合后，其吸收峰移至240 nm處，發生了紅移。肽的最大吸收峰在220 nm左右，這是由肽鍵上羰基(CO)n→π*電子躍遷引起的；當肽與Zn2+發生螯合反應后，Zn2+與肽中的N、O形成配合鍵后，影響了肽鍵上羰基(CO)n→π*電子躍遷，從而使其發生紅移。

表5 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物中氨基酸質量分數比較

由此可知肽與Zn2+之間發生了相互作用，并且生成了一種不同于肽的新化合物。紫外掃描光譜證明了肽與Zn2+發生螯合反應并有螯合物的生成。

圖5 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的紫外吸收光譜

2.4.3 傅里葉紅外光譜分析

如圖6所示，兩種物質在吸收峰位置和吸收強度方面均發生變化。肽的特征性譜帶包括酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶，分別位于3 232.11、2 922.592、1 698.979 cm-1和1 400.549～1 422.727 cm-1處。當肽分子與Zn2+離子發生相互作用生成肽鋅螯合物時，其相應的酰胺譜帶分別移至3 248.985、2 952.965、1 676.802 cm-1和1 391.389～1 430.44 cm-1處。酰胺A帶由亞氨基的伸縮振動引起，該位置受N原子和氫鍵的影響；在譜圖中，—NH的吸收峰由3 232.11 cm-1移至3 248.985 cm-1，說明在螯合過程中，肽中的—NH發生了變化，其透射率升高，可能是Zn原子替代了H原子所致。酰胺B帶與CH2的非對稱性伸縮振動相對應；在譜圖中，肽與肽鋅螯合物的譜帶位置由2 922.592 cm-1移至2 952.965 cm-1，表明CH2基團也參與了螯合反應。酰胺Ⅰ帶主要由CO的伸縮振動引起，同時還伴隨N—H的彎曲振動、C—N的伸縮振動及CN的變形振動，且譜帶波數越低氫鍵作用力越強；在圖譜中，CO的吸收峰由1 698.979 cm-1移至1 676.802 cm-1，故羰基參與了配位螯合反應，反應形成的肽鋅螯合物中相鄰鏈間的分子內相互作用力與肽相比明顯減弱。酰胺Ⅲ帶主要由—COOH的伸縮振動引起，圖譜中1 400.549～1 422.727 cm-1移至1 391.389～1 430.44 cm-1，表明—COOH可能結合了鋅。

圖6 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的傅里葉紅外光譜圖

2.4.4 能譜分析

能譜分析的原理是利用具有一定能量的電子束照射樣品，使樣品組成當中的原子或分子的電子受激發而發射出來，這些電子具有特征能量，并同時顯示表面結構的變化。兩種化合物經能譜分析可以看出，松仁肽中含有C、N、O等元素，不含有Zn元素；而松仁肽-鋅螯合物中除含有C、N、O元素外，還含有Zn元素，證明了肽鋅螯合物中Zn元素的存在。對元素進行定量分析可知，肽鋅螯合物Zn元素質量百分比為2.86%。能譜分析進一步證明了螯合反應的發生。

表6 松仁肽各元素占比 %

3 結論

松仁肽與松仁肽-鋅螯合物經過超濾、Sephadex G-50一級凝膠過濾層析分離得到P-1、P-2、P-3、P-4等4個組分及P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3等3個組分，分別測試清除羥自由基、總還原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4個指標，得出P-4和P-Zn-3組分的抗氧化能力較強，并對該組分進行Sephadex G-15二級分離，抗氧化能力比較后得出P-4-1、P-Zn-3-1的能力強。

圖7 松仁肽的能譜分析圖

表7 松仁肽-鋅螯合物各元素占比%

圖8 松仁肽-鋅螯合物的能譜分析圖

對P-4-1和P-Zn-3-1進行氨基酸組成、紫外掃描光譜、傅里葉紅外光譜和能譜的測定，松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的氨基酸組成分析可得出氨基酸質量分數在螯合前后有所變化。其中天冬氨酸的質量分數由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的質量分數由14.953%上升到16.076%，證明了酸性氨基酸質量分數高的多肽更容易與Zn2+發生螯合反應，同時也說明了酸性氨基酸與Zn2+的結合能力更強。紫外和紅外的掃描結果顯示出螯合前與螯合后的吸光度、吸收峰和吸收強度均有所變化。在能譜分析中，根據不同元素的能量來辨別不同物質的元素組成，得出的能譜結果顯示，螯合前無Zn2+的能量柱，螯合后出現Zn2+。

在對松仁肽與其Zn2+螯合物的分離純化時，以抗氧化能力作為評價標準，通過不同組分間的比較可看出，與Zn2+螯合后的化合物的抗氧化能力高于未螯合的松仁肽。將得出抗氧化能力最強的組分進行結構測定，得出的結果顯示兩者的結構表現出明顯的變化，說明了有Zn2+參與的螯合反應會對松仁肽的抗氧化能力有所影響。