應用流式細胞術對柳屬染色體倍性與基因組大小測定1)

任偉超 徐姣 樊銳鋒 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬偉

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

流式細胞術(FCM)是一種在液流系統中快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術[1]。目前已廣泛應用于植物的遺傳學、發育學及基因組大小測定的研究中。已經在廣金錢草[2]、苔蘚[3]、蘭屬[4]、黃芩[5]、紫草[6]等植物基因組大小測定中有所應用。

柳屬植物染色體倍性差異較大，包括二倍體、四倍體、六倍體，甚至十二倍體等，其中灌木類以二倍體為主，喬木類多為異源多倍體[7-9]。劉麗[10]以二倍體杞柳為對照，測定紅葉腺柳為二倍體，金絲垂柳、垂爆柳、旱柳、圓頭柳、漳河柳、黑柳、垂109為四倍體，竹柳、蘇柳J799為六倍體。張健等[11]測定旱柳的3個品種(沿江柳、9901柳、海柳1號)均為四倍體，同時應用流式細胞儀推測旱柳的基因組大小為670 Mb左右。有關柳屬倍性研究、DNA占染色體數量比例測定、染色體核型分析等細胞遺傳學的研究較少。

本研究以6種柳屬植物的圓頭柳(Salixcapitata)、烏柳(Salixcheilophila)、五蕊柳(Salixpentandra)、三蕊柳(Salixtriandra)、垂柳(Salixtriandra)、杞柳(Salixintegra)為研究對象，選取大豆(Glycinemax)、黃瓜(Cucumissativus)作為標準品；應用流式細胞術，采用單細胞液測量、混合細胞液測量2種測量方法對部分柳屬植物染色體倍性測定和基因組大小進行評估，分析不同種柳屬或同一種不同倍性的柳屬與其基因組大小之間的關聯性。旨在為柳屬細胞標記鑒定、從分子水平為柳屬植物的分類及柳屬全基因組測序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料取自哈爾濱市柳屬的無性系水培苗。培養條件——溫度25 ℃，光照期12 h，暗期12 h，光照度3 300 lx，培養20 d；取材部位為選取無病蟲害且生長特性好的新鮮嫩葉，用于染色體倍性測試和基因組大小測試(見表1)。

1.2 染色體倍性測試及基因組大小測試方法

標準品的準備：要求待測樣基因的大小，在標準品基因組大小范圍內為原則。目前已知柳屬植物的基因大小范圍342～841 Mb，按照要求，為了保證測試效果，本研究選取大豆(基因1 150 Mb)、黃瓜(基因350 Mb)作為標準品。

單細胞懸液的制備：分別取1 g柳屬待測樣新鮮葉片，放入2 mL細胞裂解液中，用鋒利的刀片將其切碎，經0.7 mm的濾膜過濾后試管收集濾液，放入離心機在1 000 r/min速度下離心5 min，棄掉上清液，收集沉淀細胞核。

表1 用于染色體倍性測試和基因組大小測試的材料

混合液制備：先用碘化丙啶染液對細胞核重懸，將細胞核懸液DNA進行熒光標記，溫度4 ℃下暗處染色20 min，再將2種以上的染液混合在一起，形成混合液。用流式細胞儀對待測樣品進行基因組大小鑒定。

樣品上機檢測：調整參數，將標準品的橫坐標固定。通過單獨上樣檢測，估算兩個標準品的粒子數，并檢查樣品質量；按比例與待測樣混勻后進行檢測，根據出現峰的橫坐標的位置，并結合大豆和黃瓜的基因組大小，通過公式計算，判斷待測樣柳屬各品種的基因組大小。

1.3 數據處理

根據標準品杞柳和待測樣的圖中峰值的相對位置，確定待測柳屬的染色體倍性，用公式計算染色體倍性水平，待測柳屬倍性水平=標準品杞柳倍性水平(待測柳屬G1峰熒光均值/柳屬標準品G1峰熒光均值)。CellQuest軟件(美國BD公司)數據下載，ModFit軟件(Yerity Software House公司)處理圖像。

2 結果與分析

2.1 染色體倍性鑒定

利用流式細胞儀測定杞柳DNA占染色體數量比例時，將出現最高峰G1設定在橫坐標數值為45附近處，以杞柳DNA占染色體數量比例的熒光強度(橫坐標)為對照，計算二者倍性系數，進而得到待測樣品的染色體倍性。杞柳在橫坐標45.51處出現1個主峰(見圖1)。

二倍體柳屬品種：流式細胞儀測定，烏柳均在橫坐標46處左右出現了主峰，烏柳的G1峰位置在橫坐標45.26處，倍數關系為0.99，表明烏柳的倍性約為杞柳倍性的1倍，即烏柳為二倍體，染色體倍性測試出峰位置(見圖2)。

圖1 流式細胞儀測定的杞柳標準品

圖2 流式細胞儀測定的烏柳染色體倍性

四倍體柳屬品種：流式細胞儀測定，圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳在橫坐標90左右出現了主峰，與標準品二倍體杞柳出現主峰的位置(45.51)比較，做倍性分析。圓頭柳的G1峰位置在95.63，倍數關系為2.10；五蕊柳的G1峰位置在橫坐標84.34處，倍數關系為1.85；三蕊柳的G1峰位置在橫坐標89.15處，倍數關系為1.96；垂柳的G1峰位置在橫坐標83.71處，倍數關系為1.84。說明4種柳的倍性約為杞柳染色體倍性(二倍體)的2倍，即圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳均為四倍體，它們在染色體倍性測試中出峰的位置見圖3。

2.2 柳屬基因組大小預測

以黃瓜(基因350 Mb)、大豆(基因1 150 Mb)為對照品，首先測試黃瓜細胞的單細胞懸液，設置DNA占染色體數量比例定為橫坐標50處左右，以此為對照，測定大豆的DNA占染色體數量比例。測定結果：黃瓜的G1峰位置在橫坐標50.95處(如圖4A)，大豆的G1峰位置在橫坐標170.23處(如圖4B)。

圖3 流式細胞儀測定的四倍體柳屬植物

圖4 流式細胞儀測定黃瓜、大豆DNA占染色體數量比例

圓頭柳基因組大小：圓頭柳的G1峰位置在橫坐標95.63處(見圖5A)。分別以黃瓜、大豆為標準品，圓頭柳基因組大小分別為656.93、646.03 Mb。此種方法獲得圓頭柳基因組大小范圍為646.03～656.93 Mb。對圓頭柳、黃瓜、大豆3者的混合樣進行測定(見圖5B)。以黃瓜、大豆為標準品，圓頭柳基因組大小為659.57、628.22 Mb。結合以上2種方法，測得圓頭柳基因組大小范圍628.22～659.57 Mb。本研究預測，二倍體圓頭柳的基因組大小約為640 Mb。

烏柳基因組大?。簽趿腉1峰位置在橫坐標45.26處(見圖6A)。分別以黃瓜、大豆為標準品，烏柳基因組大小分別為310.91、305.76 Mb；此種方法獲得烏柳基因組大小范圍為305.76～310.91 Mb。試驗結果表明，烏柳基因組大小與黃瓜較近，因此，只用大豆與烏柳的混合樣品測試(見圖6B)。以大豆為標準品，烏柳基因組大小為290.69 Mb。結合以上2種方法測得，烏柳基因組大小范圍290.69～310.91 Mb。本研究預測，二倍體烏柳的基因組大小約為300 Mb。

五蕊柳基因組大?。何迦锪腉1峰位置在橫坐標84.34處(見圖7A)。分別以黃瓜、大豆為標準品，五蕊柳基因組大小分別為579.37、569.76 Mb；此方法獲得五蕊柳的基因組大小范圍為569.76～579.37 Mb。五蕊柳、黃瓜、大豆3者混合樣進行測定(見圖7B)。以黃瓜和大豆為標準品，五蕊柳基因組大小為612.54、571.18 Mb；結合以上2種方法測得，五蕊柳基因組大小范圍569.76～612.54 Mb。本研究預測，四倍體五蕊柳的基因組大小約為580 Mb。

圖5 流式細胞儀預測圓頭柳基因組大小

圖6 流式細胞儀預測烏柳基因組大小

圖7 流式細胞儀預測五蕊柳基因組大小

三蕊柳基因組大小：三蕊柳的G1峰位置在橫坐標89.15處(見圖8A)。分別以黃瓜、大豆為標準品，三蕊柳基因組大小分別為612.41、602.25 Mb；三蕊柳的基因組大小范圍為602.25～612.41 Mb。三蕊柳、黃瓜、大豆3者混合樣(見圖8B)。以黃瓜、大豆為標準品，三蕊柳基因組大小為665.91、556.58 Mb。結合以上2種方法測得，三蕊柳基因組大小范圍556.58～665.91 Mb。本研究預測，四倍體三蕊柳的基因組大小約為610 Mb。

垂柳基因組大?。捍沽腉1峰位置在橫坐標83.71處(見圖9A)。分別以黃瓜、大豆為標準品，垂柳基因組大小為575.04、565.51 Mb；此方法獲得垂柳基因組大小范圍為565.51～575.04 Mb。垂柳、黃瓜、大豆3者混合樣進行測定(見圖9B)。以黃瓜、大豆為標準品，垂柳基因組大小為629.09、566.89 Mb。結合以上2種方法測得，垂柳基因組大小范圍565.51～629.09 Mb。四倍體垂柳的基因組大小約為580 Mb。

圖8 流式細胞儀預測三蕊柳基因組大小

圖9 流式細胞儀預測垂柳基因組大小

杞柳基因組大小：杞柳的G1峰位置在橫坐標45.51處(見圖10A)。以黃瓜、大豆為標準品，杞柳基因組大小為312.63、307.45 Mb；此方法獲得杞柳基因組大小范圍為307.45～312.63 Mb。用流式細胞儀對杞柳、大豆混合樣進行測定，杞柳基因組大小為285.51 Mb。結合以上2種方法測得，杞柳基因組大小范圍為285.51～312.63 Mb。因此，二倍體杞柳的基因組大小約為300 Mb。

圖10 流式細胞儀預測杞柳基因組大小

3 結論與討論

柳屬植物種質資源豐富，針對柳屬植物的物種鑒定也從傳統的形態學鑒定逐步發展到依據葉片圖像數字化信息的識別[12]。柳屬植物具有作為我國重要的綠化及造林樹種被廣泛應用，也具有極高的藥用價值[13]。柳屬植物具有生長迅速、更新快的特點，可以吸收土壤中的污染物，進而降低土壤污染[14-17]。柳屬的倍性研究，對柳屬全基因組測序有著重要意義。本研究利用流式細胞術對柳屬無性系的倍性進行檢測，以已知二倍體杞柳為對照，測定6種柳屬植物無性系水培苗，依據與杞柳二倍體的倍數關系，確定待測樣品的倍性。對6種柳屬進行總DNA占染色體數量比例的測試，標準品為黃瓜(基因350 Mb)[18]、大豆(基因1 150 Mb)[19]，采用2種方式進行測定(單細胞液測量和混合細胞液測量)，獲得不同基因組大小的數值范圍。

烏柳為二倍體；圓頭柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳為四倍體；結合柳屬形態學，烏柳葉片面積最小，而四倍體的4種柳的葉片面積相對較大。推斷，隨著倍性的增加，柳屬植物葉片面積增大。該結論驗證了“多倍體植物中的營養體較大，表現如葉大株高”的說法。研究結果顯示6種柳屬基因組大小，烏柳(290.69～310.91 Mb)預測值為300 Mb、圓頭柳(628.22～656.93 Mb)預測值為640 Mb、五蕊柳(569.76～612.54 Mb)預測值為580 Mb、三蕊柳(569.76～612.41 Mb)預測值為610 Mb、垂柳(565.51～629.09 Mb)預測值為580 Mb、杞柳(285.51～312.63 Mb)預測值為300 Mb。二倍體的烏柳、杞柳基因組大小數值最小，約為300 Mb；四倍體的圓頭柳基因組大小數值最大，約為640 Mb；因此6種柳屬基因組大小為285～640 Mb之間。除了烏柳、杞柳以外，均在目前已知柳屬植物基因組大小的342～841 Mb之間。