巖溶地區典型蕨類植物卷柏根系分泌有機酸特征1)

張雅潔 劉云根 王妍 楊波

(云南省山地農村生態環境演變與污染治理重點實驗室(西南林業大學)，昆明，650224)

鈣是植物必需的礦質營養元素，對植物的生長發育和生理活動起到關鍵性作用，在應對環境脅迫中處于中心調控地位[1]。研究表明，鈣缺乏會導致植物在生長過程中出現某些生理活動紊亂和病害問題[2]，高鈣則會對植物的光合作用和生長發育產生影響，抑制呼吸作用，或者阻礙信號的傳導影響植物的正常發育，嚴重還會導致細胞器破裂致使植物死亡[3]。巖溶石漠化地區土壤鈣含量高，是一般地區土壤鈣的5～15倍[4]，大量植物因高鈣影響根系發育、代謝途徑、細胞結構造成無法正常成長甚至死亡[5-7]，僅有少數耐鈣或喜鈣植物能正常生長[8]，因此在喀斯特石漠化生態恢復過程中，物種選擇至關重要。卷柏(Selaginellatamariscina)為多年生草本，是巖溶地區常見的先鋒植物，對各種極端惡劣環境有較強的適應能力[9]，目前對卷柏的研究成果主要集中在其地上部分藥用價值方面，已知葉片中分離得到包括黃酮、生物堿、多糖、有機酸等物質[10]。但鮮有關于卷柏生態適應性以及對環境修復方面的報道。而根系分泌物是植物長期適應外界環境而形成的一種適應機制。在根系分泌物中，有機酸影響根際環境，在眾多的根系分泌物質中作用最為重要，研究表明，根系分泌有機酸改變了土壤的理化性質，以促進植物對所需養分的吸收[11]，并對植物的多種生理生態過程起到重要影響，調節植物對環境的適應性，增強對不良環境的抗性，而根系對于土壤中的脅迫作用往往能做出反應，因此探析植物根系分泌物對巖溶地區的高鈣環境的適應性，對巖溶地區生態系統恢復和重建具有重要意義。本研究采用砂培方式測定不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌有機酸種類和組成特征，探析巖溶地區典型先鋒植物卷柏對高鈣環境的適應機制，以期為石漠化地區植被恢復提供理論參考和技術指導。

1 材料與方法

卷柏(S.tamariscina)，為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)卷柏的全草，多年生草本，又名長生不死草、九死還魂草、石蓮花等，是一類出現于中石炭世的原始而古老的蕨類植物[12]。卷柏分布廣泛，多生于向陽的山坡巖石上，或干旱的巖石縫中，該種既可觀賞，又有很高的藥用價值。本研究供試卷柏采集自云南省昆明市西山向陽坡巖溶山地，所采植株保證生長狀況、植株大小基本一致。

1.1 試驗設計與處理

試驗采用室內模擬的方式進行，控制室溫在(25±1)℃。采用控制霍格蘭營養液中硝酸鈣(Ca(NO3)2)的方式配制成7種鈣梯度的營養液，硝酸鈣濃度分別為0、5、30、70、100、200、300 mmol·L-1，每種梯度設置5個重復，共35個處理。其中0 mmol·L-1的Ca2+模擬缺鈣環境，5 mmol·L-1用以模擬酸性土中交換態鈣平均濃度，100 mmol·L-1用以模擬石灰土中交換態鈣平均濃度，并將營養液pH值控制在6.0～6.5，一次性配制試驗期間所用營養液。培養基質石英砂在植物移栽前先用水浸泡，后加入5%鹽酸浸泡24 h后用過量水沖洗至中性后裝盆晾干，以排除其它因素對實驗結果的影響。待植物生長正常后移栽植株，移栽過程中保證根系完整，清洗植株并作消毒處理，至石英砂環境下培養，每個鈣梯度設置5個平行處理，每盆1株植物。每天每盆施入100 mL營養液，保證各處理的施入量和施入時間一致。移栽30 d后統一收集卷柏根系分泌物，具體步驟如下：(1)將植物從石英砂中取出，用200 mL去離子水沖洗根部，通過雙層定性濾紙過濾，即得到根系分泌物的粗提物；(2)將粗提物加入V(分液漏斗)∶V(二氯甲烷)=1∶1萃取2次，合并萃取液；(3)萃取液放至旋轉蒸發儀濃縮蒸發，減壓濃縮至干后用2 mL分析甲醇潤洗溶解有機相并過0.45 μm有機濾膜后裝入2 mL棕色液相瓶冷藏保存備用。

1.2 測定方法

提取后的根系分泌物采用GC-MS(Agilent 7890A-5975C)測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍m/z30～600 amu，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細管柱：HP-5MS柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃(2 min)，以6 ℃/min程序升溫至250 ℃(保持15 min)。載氣為He，流量1 mL/min。應用NIST08質譜數據庫，分析質譜圖，確定各組分物質名稱，并采用峰面積歸一化法計算各物質的質量分數。

1.3 數據處理與分析

采用SPSS17.0、Microsoft Excel 2010等軟件對實驗數據進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 巖溶地區鈣對根系分泌有機酸種類的影響

在缺鈣條件下，卷柏根系分泌有機酸的種類最多，共有12種酸類物質(表1)。當在有少量Ca2+出現的酸性土環境時，根系分泌有機酸的種類為9種。之后隨著鈣濃度增加卷柏根系分泌物中的有機酸種類逐漸減少，Ca2+濃度為30和70 mmol·L-1時，根系分泌有機酸種類相同為6種。當Ca2+濃度增加到100 mmol·L-1的石灰土環境時，共檢測出5種有機酸。之后當Ca2+濃度增加到200和300 mmol·L-1的高鈣環境時檢測出的有機酸種類分別為4種和3種。

在缺鈣環境下卷柏根系會產生更多種類的根系分泌有機酸，相比酸性土環境增加了3種。鈣濃度達到酸性土鈣含量后隨著鈣離子濃度的增加卷柏根系分泌有機酸的種類開始減少，5到30 mmol·L-1之間鈣濃度相差較小，但有機酸種類存在顯著差異，而30與70 mmol·L-1以及200與300 mmol·L-1之間雖鈣濃度跨度較大，但有機酸種類間沒有顯著差異。用以模擬缺鈣、酸性土、石灰土的0、5、100 mmol·L-13種梯度間有機酸種類均存在顯著差異。

表1 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸種類的影響

2.2 巖溶地區不同鈣濃度條件下根系分泌有機酸特有成分

使用峰面積歸一化法計算不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌的特有酸的質量分數，從表2可以看出檢測出的特有酸都是低質量分數有機酸。當在酸性土環境時，存在6種特有酸，花生酸(0.36%)、木蠟酸(0.21%)、山萮酸(0.17%)、正十七烷酸(0.10%)、亞油酸(0.55%)、棕櫚油酸(0.69%)。缺鈣條件下的特有酸種類最多，共鑒定9種，相比酸性土環境增加了肉豆蔻酸(0.13%)、正十五烷酸(0.09%)、3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸(0.06%)3種特有有機酸，這3種酸僅在缺鈣條件下分泌，是卷柏根系在缺鈣環境中分泌的特有性有機酸，此外，除正十七烷酸的質量分數與在酸性土條件下相同外，其它幾種特有酸的質量分數都有不同程度的增加。

當Ca2+濃度從酸性土環境增加到30 mmol·L-1時，木蠟酸、正十七烷酸、山萮酸消失，其它特有酸的質量分數也相對降低。隨著鈣濃度升高，各類特有有機酸開始逐漸從組分中消失。當Ca2+濃度到達石灰土環境時，僅存在花生酸(0.11%)、亞油酸(0.15%)，當鈣濃度達到300 mmol·L-1時，特有酸全部消失。

表2 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸特有酸類質量分數的影響

2.3 巖溶地區鈣不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌有機酸共有成分與分布特征

在7種不同鈣濃度環境下都出現的共有酸有3種，油酸、棕櫚酸及硬脂酸。油酸在酸性土環境下質量分數為11.5%，在缺鈣環境下質量分數陡然上升到31.21%。酸性土與石灰土環境下油酸的質量分數也存在顯著差異，但相比缺鈣環境質量分數的變化較為穩定。棕櫚酸及硬脂酸在酸性土環境下的質量分數分別為7.12%和2.15%，在缺鈣時質量分數也出現了顯著性的增加，增加幅度小于油酸在相同環境間的變化幅度。在Ca2+濃度從酸性土環境逐漸向石灰土環境增加的過程中，油酸質量分數在Ca2+濃度30至70 mmol·L-1之間變化較小，直到達到石灰土環境時才出現顯著差異；棕櫚酸質量分數的變化則是當濃度達到70 mmol·L-1時就開始減緩；而硬脂酸相比其它兩種酸，在整個過程中都保持一個相對較緩、變化較小的規律。當Ca2+濃度達到酸性土環境后，相比之前Ca2+濃度梯度間的跨度增大，但3種酸的質量分數的變化幅度一致變緩。油酸及硬脂酸在3個濃度間的質量分數沒有顯著差異，棕櫚酸質量分數在Ca2+濃度200 mmol·L-1后也開始沒有顯著性差異。

在缺鈣條件下，由于環境中缺鈣，根系分泌油酸、棕櫚酸及硬脂酸都顯著高于酸性土環境。Ca2+濃度在酸性土到石灰土環境區間內，隨著鈣濃度的升高對植物根系分泌有機酸產生了抑制作用，3種酸的質量分數開始持續降低，在每個梯度之間都存在一定的顯著差異。直到Ca2+濃度達到石灰土環境后，3種酸的質量分數變化開始趨于穩定，Ca2+的增加幅度加大，但3種酸類的質量分數沒有顯著差異，基本穩定在一個相近的數值內。

在7種Ca2+濃度梯度下，油酸的質量分數始終比其它兩種酸更大，尤其在缺鈣環境下植物分泌大量的油酸。酸性土環境時硬脂酸質量分數較棕櫚酸和油酸的質量分數較小，油酸質量分數顯著大于棕櫚酸質量分數。在Ca2+濃度達到石灰土環境的過程中，3種酸都有不同程度的降低，3種酸的質量分數開始慢慢接近，Ca2+濃度達到石灰土環境時，硬脂酸質量分數依然相比其它兩種酸較小，但油酸與棕櫚酸之間的質量分數非常接近。之后隨著鈣濃度繼續大幅增加，3種酸質量分數的差值繼續減小，當鈣離子濃度到達300 mmol·L-1時3種酸的質量分數之間的差值達到最小。可以看出，在高鈣環境時，棕櫚酸、油酸和硬脂酸的質量分數不再隨著鈣濃度的增加出現較大變化，且都穩定保持在一個較低但相對接近的濃度(表3)。

表3 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸共有酸質量分數的影響

3 結論與討論

目前，關于根系分泌有機酸的相關研究主要集中在農作物、經濟林木、草本植物和濕地植物，關于蕨類植物根系分泌有機酸的研究較少。而不同植物根系分泌有機酸的種類和分泌量也不同，通過此次研究得到了蕨類植物卷柏根系中穩定分泌的有機酸為棕櫚酸、油酸、硬脂酸，隨著環境中的鈣濃度變化這3種有機酸始終穩定存在，且有相對較高的含量。根系是植物對土壤環境反應最敏感的部位，在植物受到環境影響時植物根系往往最先做出反應，而根系分泌物是植物根系對土壤環境生化適應的產物，植物在生長過程中，根系從環境中攝取養分的同時，也向環境中釋放大量有機物，任何影響植物生長和生理的因素均會影響根分泌物的數量和種類[13-14]。已有研究表明，在養分缺乏的情況下，植物根系通過增加根系分泌有機酸的含量來應對，如缺磷環境下的構樹、桑樹、諸葛菜和油菜根系分泌有機酸的總量都增加[15]；缺鐵導致鷹嘴豆根系分泌有機酸增加5～10倍[16]；缺鋅促進了蘋果有機酸向地下部的分配，根和莖中草酸和蘋果酸的濃度提高了1.09～1.35倍，有機酸向根系的分配比例增加[17]。本研究的結果也驗證了這一觀點：鈣作為植物生長中不可或缺的營養元素，在鈣元素缺乏的情況下，卷柏通過增加根系分泌有機酸含量和種類，增加了肉豆蔻酸、正十五烷酸、3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸這3種缺鈣脅迫下產生的特有酸，以及提高棕櫚酸、油酸、硬脂酸3種共有有機酸的含量，即產生誘增有機酸來減輕逆境環境對植物的影響，促進植物對養分的吸收和利用，增加植物適應性以及保護植物的細胞膜系統[18]。所以在鈣濃度為0 mmol·L-1條件下，由于根際環境缺鈣卷柏根系開始分泌多種特有的低濃度有機酸，以及其它共有酸的質量分數也明顯提高，這可能是卷柏應對營養元素缺乏時根系做出的適應機制，通過提高根系分泌有機酸的種類以及含量來提高植物抗性，保護養分缺乏對植物細胞膜系統的破壞。其中油酸質量分數的增加尤為顯著，而油酸作為一種單不飽和脂肪酸，對植物響應多種非生物環境影響具有多重調節功能[19]，缺鈣時卷柏分泌的大量油酸可能也對植物起到了重要的調節作用。

目前就高鈣條件對植物根系分泌物的影響的研究尚未見報道，在本研究中，以5 mmol·L-1鈣濃度模擬酸性土，100 mmol·L-1鈣濃度模擬石灰土，從酸性土到石灰土，隨著鈣濃度的增加，植物根系分泌有機酸的種類逐漸減少，各酸類的質量分數也有顯著降低。這是因為鈣離子對植物的生長和生理產生了影響，抑制了根系對有機酸的分泌，從而導致根系分泌有機酸的種類和含量產生了變化。而當鈣濃度達到石灰土的高鈣環境后，鈣離子的增加幅度變大，但根系分泌共有有機酸棕櫚酸、油酸、硬脂酸的質量分數開始趨于穩定，不再隨鈣離子濃度的變化而產生較大變化，且3種酸的質量分數也保持在相似的數值。相關研究表明，天然脂肪酸類物質在防治植物病害、調節植物生理生態和生長發育以及改善土壤的理化性質方面有著很高的價值[20]。棕櫚酸和油酸明顯影響了植物的生理代謝，促進了植物的生長發育，兩種脂肪酸提高了土壤中的酶活性，促進土壤中有機養分的轉化，并且明顯降低土壤中真菌的數量[21]。這可能是卷柏能在高鈣的巖溶地區生存的原因，在面對極端逆境的高鈣情況下，卷柏根系分泌的棕櫚酸和油酸兩種脂肪酸能保持在一個較穩定的狀態，調節卷柏在逆境中的生理活動，但脂肪酸促進卷柏抵抗高鈣環境的具體作用機理還有待進一步的研究。

綜上所述，從植物抗逆性的角度考慮，卷柏能夠在高鈣環境的石灰土上正常生存的原因在于：當根際土壤處于高鈣條件時，卷柏能夠保持棕櫚酸、硬脂酸、油酸3種共有酸相對穩定的分泌量，較穩定的有機酸含量為卷柏維護了根際環境的相對穩定。

實驗設計Ca2+營養液7個濃度梯度上，卷柏根系分泌有機酸中的穩定成分有棕櫚酸、油酸和硬脂酸，3種酸在所有濃度梯度上都具有相對穩定的含量，且在高濃度梯度環境下不具有顯著性變化；在缺鈣條件下，植物根系分泌有機酸種類增加，出現了多種僅在此濃度梯度下存在的特有酸，且3種共有酸成分的質量分數都明顯增加；高鈣環境下，根系分泌有機酸的種類相比低鈣條件下降低，低鈣脅迫下的特有酸逐漸消失，但3種共有有機酸保持在一定穩定水平，且鈣濃度越高3種穩定根系分泌有機酸的質量分數越趨于一個穩定值。