脯氨酸羥化酶GhP4H2在棉花纖維發育中的功能研究

高 璐 許文亮

脯氨酸羥化酶GhP4H2在棉花纖維發育中的功能研究

高 璐1,2許文亮1,*

1華中師范大學生命科學學院 / 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室, 湖北武漢 430079;2山西農業大學小麥研究所, 山西臨汾 041000

阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP)在棉花纖維發育過程中發揮重要作用。AGP由富含羥脯氨酸的主鏈蛋白和大量II型阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)側鏈組成, 其合成過程要經歷2次翻譯后修飾, 首先是氨基酸主鏈上的脯氨酸被脯氨酸羥化酶(prolyl-4-hydroxylases, P4H)羥基化, 隨后在糖基轉移酶(glycosyltransferases, GT)催化作用下將阿拉伯半乳聚糖或寡糖添加到羥脯氨酸殘基上。我們前期利用P4Hs的抑制劑處理棉花離體胚發現, 棉纖維伸長受到抑制, 暗示P4H參與棉纖維生長發育過程。為深入研究P4H在棉纖維發育中的功能, 我們從棉花中分離鑒定了1個在棉纖維發育過程中高量表達的脯氨酸羥化酶基因。本研究分別構建了過表達和RNA interference (RNAi)載體, 通過農桿菌介導法轉化棉花, 獲得轉基因植株, 發現過表達轉基因棉花株系T1~T3代成熟棉纖維變短, AGP含量增加, AG多糖側鏈也發生變化。對過表達轉基因植株和野生型植株棉纖維的轉錄組分析表明, G正調控包括AGP在內的細胞壁糖蛋白基因的表達。基于以上研究, 我們推測可能主要通過影響AGP糖鏈組分調控棉纖維生長發育。

棉纖維; 阿拉伯半乳聚糖蛋白; 脯氨酸羥化酶

棉花作為世界上最大的纖維作物和紡織工業原料, 品質是其經濟價值的重要考量因素。棉纖維是由棉花胚珠外珠被表皮層的單細胞發育而成, 是自然界最長的單細胞之一。細胞壁作為棉纖維的重要組分, 其合成過程直接決定著棉纖維的品質參數[1], 它是一個復雜的動態結構, 由90%高分子量的多聚物和少量糖蛋白組成[2]。雖然糖蛋白組分占比很少, 卻是細胞壁形態構成和功能發揮的重要因子。富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins, HRGP)代表細胞壁糖蛋白的一個大家族, 根據其核心蛋白的糖基化程度, 可分為高度糖基化的阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP), 中度糖基化的伸展蛋白(extensins, EXT)以及輕度糖基化的富含脯氨酸蛋白(proline-rich proteins, PRPs) 3類[3-5]。PRP廣泛存在于不同作物中且功能不等, 如參與玉米胚的發育[6-7]、響應大豆干旱和鹽脅迫應答[8]等。我們前期從棉花cDNA文庫中分離了3個PRP家族基因, 命名為、和, 發現在下胚軸和根中高量表達,在棉花開花后10 d (days post anthesis, DPA)胚珠中優勢表達[9]。在擬南芥中表達基因增強了轉基因擬南芥對鹽和ABA的敏感性[10]。RNAi轉基因棉纖維的長絨和短絨均增長, 酵母雙雜交表明, GhPRP5可形成同源和異源二聚體發揮功能, 推測通過復雜的調控網絡影響細胞壁的合成從而影響棉纖維的發育[11]。AGP可能是自然界中翻譯后修飾程度最高的蛋白, 其合成過程包括N末端信號肽序列的切割、由脯氨酸羥化酶(prolyl 4-hydroxylases, P4Hs)催化的脯氨酸殘基的羥基化、GPI錨的修飾和羥脯氨酸殘基上的阿拉伯半乳聚糖糖基化。它是一類O-糖基化蛋白, O-糖基化部位主要發生在含有絲氨酸(Ser)和羥脯氨酸(Hyp)的肽鏈中[12], 廣泛參與細胞膨脹、細胞分化、生殖發育、體細胞胚胎發育、木質部分化、非生物脅迫應答、激素信號應答等過程[5]。AGP功能的發揮很大程度上依賴于占到整個分子量90%以上的糖側鏈[13], 擬南芥突變體中AGP分子的糖側鏈缺失巖藻糖, 使得根長明顯變短[14]。在中, TTS蛋白參與花粉管的伸長, 但去糖基化的TTS蛋白喪失該功能[15]。近年來, 已經篩選出大量編碼AGP合成的基因, 根據核心蛋白中氨基酸的組成, AGP可分為典型性和非典型性兩大類, 成束蛋白樣阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan proteins, FLAs)作為典型性AGP的代表, 廣泛存在于擬南芥[16]、水稻[17]、小麥[18]、毛果楊[19]、大麻[20]、陸地棉[21]、海島棉[22]等多種植物中。我們之前從棉花中分離了19個編碼FLA的基因, 其中的3個()在10 DPA纖維中優勢表達。我們進一步的研究發現, 過表達可以促進纖維伸長而抑制表達減緩了纖維起始和伸長。免疫組學分析顯示,影響AGP組分尤其是AG多糖側鏈的合成[21]。隨后, 我們又分離了糖基轉移酶基因GT31家族成員, 發現其參與AGP (主要是FLA) II型AG糖鏈β-1,3-半乳糖苷鏈的合成, 通過調控的表達, 導致轉基因株系棉纖維細胞壁的形態結構發生明顯變化[23]。綜上, AGP多糖側鏈在棉纖維發育過程中發揮重要的作用, 但對于催化脯氨酸羥基化的脯氨酸羥化酶在棉纖維發育過程中的作用還不清楚。

P4H是普遍存在于動物和植物中的一種2-氧化戊二酸雙加氧酶, 主要定位于內膜系統, 其功能的發揮需要Fe2+、α-酮戊二酸、O2等的參與[24]。動物等高級生物中P4H分為兩大類, 影響膠原蛋白合成的C-P4H和缺氧誘導HIF-P4H。C-P4H是膠原蛋白合成的關鍵因子, 這類P4H以α2β2四聚體結構發揮功能, β-基序形成二硫鍵異構酶, α-基序則形成催化亞基, 催化底物氨基酸序列-X-Pro-Gly-中的Pro羥基化[25-26]。目前植物中關于P4H的報道還較少, 與動物中C-P4H不同的是其只含有α催化亞基, 催化底物中位于Ala、Gln、Hyp、Pro、Ser、Thr和Val之后的Pro羥基化, 但位于其他氨基酸之后的第1個Pro不能被羥基化。P4H催化的底物EXT中的Pro為連續的2~4個單元, 并且始終毗鄰Ser(Ser-(Pro)2-4), 羥基化后形成Ser-(Hyp)2-4。當AGP作為催化底物時, AP/PA/SP/TP重復序列是其羥基化的敏感位點。而PRPs的PPVX [KT]、KKPCPP和PPV序列以及其他富含Pro的嵌合蛋白XPnY基序是其催化的靶序列。光譜測定和生物信息學方法預測到了擬南芥中AtPRP4 (富含32.5% Pro)、At1g09750、At1g31580 (含27%~28% Pro)、At3g08030、At2g10940 (含6%~8% Pro)催化底物序列Pro的定位, 證明了Pro羥基化序列的多樣性和特異性[27]。萊茵衣藻中共有10個基因, 但只有的功能得到證實, 缺陷型導致細胞壁的合成受阻[28]。

棉花是世界上最重要的經濟作物之一, 目前關于棉花中的報道還尚屬空白。P4H功能的發揮離不開保守殘基與2-氧戊二酸鹽(2-oxoglutarate)和Fe2+的結合。3,4-二羥基苯甲酸乙酯(ethyl-3,4-dihydroxybenzoate, EDHB)和α,α-聯吡啶(α,α-Dipyridyl, DP)是P4H酶的2種抑制劑, EDHB可以特異結合2-oxoglutarate, DP則通過螯合Fe2+抑制P4H酶活[29]。我們前期用不同濃度梯度的EDHB和DP處理棉花離體胚珠后, 棉纖維伸長受到嚴重抑制, 且抑制程度與抑制劑濃度呈正相關, 說明參與棉纖維生長發育[12]。隨后, 我們從棉花基因組中識別了30個可能編碼P4H的基因, 許多P4H家族基因在纖維發育的不同階段高量表達, 進一步表明這些基因可能在纖維發育過程中起作用。為研究P4H在棉纖維發育過程中的功能, 本研究克隆了一個在棉纖維伸長期高量表達的P4H家族基因, 通過農桿菌介導法轉化棉花, 獲得轉基因棉花植株, 旨在了解P4H在棉纖維發育過程中的功能, 為棉纖維發育的分子機制提供新的視野。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究選用陸地棉(L.) Corker 312品種為棉花遺傳轉化受體。1/2 MS培養基培養棉花無菌苗5~6 d, 將棉花下胚軸切成10 mm左右的小段, 并用含有過量表達載體或RNAi載體的農桿菌LBA4404懸浮液浸染15 min, 然后將外植體轉移到共培養培養基上(不含任何抗生素)在28℃ (16 h光照/8 h黑暗)下共培養2 d, 后續詳細繼代培養步驟參照Qin等[23]的方法。獲得的轉基因幼苗轉移至溫室土壤中用于目的基因的鑒定和遺傳分析。

1.2 棉花基因組DNA提取

取棉花幼苗2 g左右幼葉, 利用CTAB法提取基因組DNA[23]。

1.3 載體構建

設計帶有I和I酶切位點的OE引物(表1), 利用Primer STAR高保真酶擴增開放閱讀框序列, 連接到克隆載體pSK上, 測序驗證沒有堿基突變后構建到表達載體pBI121上獲得pBI121過表達載體。

兩端酶切位點為H I和I的L1引物(表1)擴增正義鏈, 酶切位點為I和I的L2引物(表1)擴增反義鏈, 正義鏈和反義鏈中間有一個基因內含子(Intron), 兩端酶切位點分別為I和I。將正義鏈-Intron-反義鏈序列構建到pBI121質粒中, 獲得pBI121RNAi載體[23]。

1.4 RNA提取和實時定量RT-PCR

利用TianGen RNA試劑盒提取棉花RNA。逆轉錄獲得cDNA, 將各個樣品的cDNA稀釋到濃度相當后對基因進行實時定量RT-PCR分析[23]。棉花泛素基因(,)作為內參, 本研究所用基因RT-PCR引物見表1。

1.5 棉纖維AGP的分離、純化及定量分析

按照Qin等[23]的方法, 取10 g冷凍干燥的10 DPA纖維, 加入液氮研磨成粉末后, 加入10 mL緩沖液(50 mmol L-1Tris-Cl, 10 mmol L-1pH 8.0 EDTA, 0.1% β-巰基乙醇, 1% (w/v) Triton X-100), 4℃孵育3 h。14,000′離心10 min, 取上清加入10 mL乙醇, 4℃孵育過夜。離心棄上清, 5 mL 50 mmol L-1Tris-Cl重懸沉淀, 冷凍干燥過夜。350 μL 1% NaCl重懸樣品, 加入350 μL的β-Yariv, 混勻, 4℃過夜。14,000′離心1 h, 1% NaCl洗滌沉淀3次, 甲醇洗滌沉淀2次去除β-Yariv, 靜置干燥, 加入適量二甲基亞砜至沉淀完全溶解, 加入微量亞硫酸鈉, 再加入適量超純水至溶液呈亮黃色, 溶液過PD-10柱脫鹽, 所得即為AGP溶液。

AGP濃度測定按Qin等[23]的方法, 配制濃度為1%瓊脂糖, 0.02% 疊氮鈉(NaN3), 0.15 mol L-1NaCl以及10 μg mL-1β-Yariv的溶液20 mL, 加熱至沸騰, 待瓊脂糖完全融化后, 將混合液倒入培養皿中, 冷卻。用直徑為2 mm的玻璃吸管對冷卻的凝膠打孔。取1 μL AGP點樣, 均勻點入每個孔中, 并選擇濃度為0.1~0.6 μg μL-1的阿拉伯樹膠作為標樣對照。將平板置于黑暗潮濕的環境中過夜。測量每個擴散色圈的直徑, 并計算色圈面積, 根據標樣繪制標準曲線并計算出各個待測樣品的濃度。

1.6 Immuno Dot blot分析

根據Qin等[23]的方法進行Dot blot分析野生型與轉基因棉花株系中AGP的差異。分別利用JIM8和JIM13作為一抗, 堿性磷酸酶標記的山羊抗大鼠IgG(H+L)作為二抗進行免疫組織化學反應。

1.7 轉錄組分析

收取野生型和過表達株系5 DPA纖維,利用Spectrum plant total RNA Kit試劑盒提取總RNA, 純化后檢測RNA的完整性。將完整性好的RNA進行RAN-seq (北京諾禾致源基因公司)。GO (Gene ontology)預測差異基因功能并分類, 以值為依據, 篩選出差異表達基因進行RT-PCR驗證。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 GhP4H2蛋白的系統進化分析和基因表達譜

利用Clustalx、MEGA7.0 (http://www.megasoftware. net/)對擬南芥P4H與棉花GhP4H2進行系統進化樹分析(圖1-A)發現, GhP4H2與AtP4H2、AtP4H4處于同一個亞支, 親緣關系最近。

為研究基因在棉花中的表達模式, 提取棉花的根、下胚軸、子葉、真葉、花瓣、花藥、15 d胚珠及不同發育時期纖維的RNA, 逆轉錄后進行實時定量RT-PCR分析。基因在子葉、真葉、花藥中高量表達, 在纖維發育的不同時期(0~20 DPA)均有較高水平的表達, 且在5 DPA和9 DPA纖維中保持較高的表達量(圖1-B), 暗示可能參與棉纖維伸長過程。

A: 棉花GhP4H2與擬南芥GhP4H蛋白系統進化關系; B:基因在棉花各組織的表達譜。1: 根; 2: 下胚軸; 3: 子葉; 4: 真葉; 5: 花瓣; 6: 花藥; 7: 15 DPA胚珠; 8: 0 DPA纖維(含胚珠); 9: 3 DPA纖維(含胚珠); 10: 5 DPA纖維; 11: 9 DPA纖維; 12: 15 DPA纖維; 13: 20 DPA纖維。DPA: 開花后天數。誤差線代表標準誤差。

A: phylogenetic relationship of GhP4H2 andP4Hs; B: expression analysis ofin different cotton tissues. 1: root; 2: hypocotyl; 3: cotyledon; 4: leaves; 5: petals; 6: anthers; 7: 15 DPA ovule; 8: 0 DPA fiber (with ovule); 9: 3 DPA fiber (with ovule); 10: 5 DPA fiber; 11: 9 DPA fiber; 12: 15 DPA fiber; 13: 20 DPA fiber. DPA: days post anthesis. Error bar represents the standard deviation.

2.2 轉基因棉花株系中GhP4H2的表達分析

為研究在棉纖維生長發育過程中的功能, 本研究分別構建了由35S啟動子驅動的過表達(overexpression, OE)和RNA interference (RNAi)載體,通過農桿菌介導法轉化棉花下胚軸, 獲得轉基因棉花植株。取不同轉基因株系5 DPA和10 DPA纖維進行表達量鑒定表明,基因在RNAi (Ri)株系L16和L28中表達量顯著低于WT, 在過表達株系L10和L38中表達量顯著增加(圖2)。我們后續研究選擇RiL16、RiL28、OEL10、OEL38這4個轉基因株系進行表型分析。

2.3 GhP4H2轉基因棉花成熟纖維表型分析

分析T1~T3代成熟纖維表型變化發現, 與野生型相比,過表達株系的成熟棉纖維長度顯著變短, 而RNAi株系沒有明顯變化。脫絨后比較不同株系種子形態大小, 未發現明顯差異(圖3), 表明主要影響纖維發育而對胚珠影響較小。

2.4 GhP4H2轉基因棉纖維AGP含量分析

考慮到AGP基因數目占了棉纖維HRGP基因的絕大多數[23], 我們推測AGP可能是P4H的首選底物。為研究對AGP合成的影響, 本研究提取了10 DPA纖維AGP進行定量檢測。以0.1~0.6 μg μL-1濃度梯度的阿拉伯樹膠作對照, 繪制折線圖并計算各轉基因株系中AGP樣品濃度(圖4)。RiL28中AGP含量明顯低于WT, RiL16中AGP含量有輕微減少; 而過表達株系OEL38中含量顯著增加, OEL10中AGP含量有輕微增加, 但未見顯著差異。

2.5 GhP4H2影響AGPs多糖側鏈的合成

為研究對AGP糖側鏈合成的影響, 本研究用不同的抗體進行了Dot blot分析。其中, JIM8、JIM13能夠與AGP糖側鏈抗原決定簇特異性結合, JIM8特異結合阿拉伯半乳糖側鏈, JIM13特異結合β-GlcA-(1,3)-α-Gal-(1,2)-Rha側鏈。由圖5可知, RNAi株系雜交信號與WT相比減弱, 并且JIM8雜交信號弱于JIM13。過表達株系則呈現相反趨勢。說明轉基因株系中影響了AGP糖側鏈的組成。

A:在不同株系5 DPA纖維中表達分析; B:在不同株系10 DPA纖維中表達分析。RiL16、RiL28表示2個獨立的RNAi株系; WT表示野生型; OEL10、OEL38表示2個獨立的過表達株系。**表示在0.01水平差異顯著。

A and B: quantitative RT-PCR analysis ofexpression in 5 DPA (A) and 10 DPA (B) fibers from independent transgenic cotton lines and wild type. RiL16 and RiL28 represent two independent-RNAi lines; WT represents the wild type; OEL10 and OEL38 represent two independentoverexpression lines. ** means significant difference at the 0.01 probability level.

A:轉基因棉花與WT成熟種子和纖維表型比較; B:轉基因棉花與WT成熟纖維長度比較。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A and B: measurement and statistical analysis of mature fiber length and seed size of the transgenic cotton plants and wild type. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

A: 不同樣品AGP特異反應色圈。B: 阿拉伯樹膠標準曲線; 橫坐標代表AGP濃度, 縱坐標代表對應的色圈面積。C: 不同樣品AGP含量。0.1~0.6 (μg μL-1): 阿拉伯樹膠濃度。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A: halos of different samples from transgenic lines and wild type. B: standard curve; Abscissa: the AGPs concentration; Ordinate: the area of the corresponding halos. C: the AGPs content of different samples from transgenic lines and wild type. 0.1–0.6 (μg μL-1): gum arabic concentration. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

-: PBS陰性對照。+: 1 mol L-1arabic gum陽性對照。株系名稱縮寫同圖2。

-: PBS negative control. +: 1 mol L-1arabic gum positive control. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

2.6 GhP4H2影響棉纖維細胞壁相關基因的表達

為研究在棉纖維發育過程中的調控通路, 取野生型和過表達株系OEL38的5 DPA纖維進行轉錄組測序分析。本研究主要關注細胞壁相關基因。與WT相比, OEL38株系202個上調差異表達基因中與細胞壁合成相關的有15個(圖6-A), 其中編碼HRGP的基因有8個, 占到細胞壁基因的53.3%,、屬于AGP類,、屬于EXT類,、、、屬于PRP類。因此推測這些編碼HRGP的基因很可能是作用的靶基因。選擇這8個基因進行RT-PCR表達驗證(圖6-B)發現, 這8個基因在OEL38中表達量均顯著升高, 說明可能通過催化這些底物來調控棉纖維發育。

2.7 GhP4H2影響糖基轉移酶基因(GhGalTs)的表達

我們之前的研究顯示,參與棉纖維發育過程[23]。位于下游, 為研究對表達的影響, 本研究選擇家族部分基因進行表達分析(圖7)。選擇的7個基因中有4個基因(和)在過表達株系中的表達量發生變化, 表明可能影響了AGP糖基化過程, 這可能是AGP糖側鏈發生改變的原因。

3 討論

先前有研究發現,參與擬南芥低氧應答, 過量表達致使擬南芥發生根毛增長, 毛狀體缺失, 種子變小等變化, 同時導致與缺氧應答相關基因表達量升高。轉錄組數據顯示,還參與光合作用、JA信號轉導、植物激素調控等過程[30]。另外, 有研究表明, AtP4H5分別通過與AtP4H2和AtP4H13形成異源二聚體發揮Pro羥基化功能, 并且優先羥基化EXT, 三者共同調控擬南芥根毛的伸長[31]。敲除會促進番茄根的伸長和葉子的發育, 免疫組學分析顯示, 與JIM8特異性結合的AGP糖鏈組分缺失[32]。擬南芥和突變體中, 根毛相對于野生型都變短, DP和EDHB處理也會抑制根毛的伸長[31]。前期我們分別用DP和EDHB處理棉花離體胚發現, 棉纖維的生長發育受到了明顯的抑制, 推測參與調控棉纖維的生長發育[12]。本研究克隆了基因獲得過表達和RNAi不同株系轉基因棉花, 對T1~T3代成熟棉鈴進行表型分析發現,-RNAi株系長絨與WT相比并沒有明顯變化, 這可能是由于基因功能冗余的原因。而OE株系的成熟纖維明顯短于WT。Dot blot分析顯示, JIM8和JIM13的雜交信號均增強。我們前期證實促進棉纖維的生長發育, 免疫組學分析顯示,轉基因株系AGP側鏈糖組分發生不同程度的變化, 其中過表達株系中JIM13雜交信號減弱, 說明過表達株系中與JIM13特異結合的AGP表位抗原決定簇減少[21]。隨后我們發現過量表達的棉纖維伸長受到抑制, 經免疫組學分析, JIM8和JIM13的雜交信號均增強, 表明過量表達會增加與JIM8和JIM13特異結合的AGP表位抗原決定簇豐度[23]。本研究與過表達棉纖維取得的結果一致, 我們推測過表達轉基因棉纖維變短的原因與類似。而在RNAi株系中AGP變化的程度可能不足以明顯影響纖維發育。前期我們的結果顯示,正調控基因的表達[23], 本研究依據轉錄組及RT-PCR結果, 證實篩選到的8個表達AGP、EXT、PRP的差異基因受調控, 可能是其下游靶基因, 后續又發現影響下游的表達, 暗示GhP4H2不僅僅影響HRGP羥基化, 對參與糖基化的糖基轉移酶基因的表達也有影響, 而轉基因株系中AGP的變化很可能正是由于GhP4H2與GhGalTs協同調控引起。但過表達株系成熟纖維表型差異是否與AGP核心蛋白變化有關？AGP可能是GhP4H2優先催化的底物, EXT或PRP也是其作用底物嗎？這些問題都有待深入研究。

A: 細胞壁相關基因的主要類別; B: 糖蛋白相關基因的表達驗證。PRP: 富含脯氨酸蛋白; AGP: 阿拉伯半乳聚糖蛋白; EXT: 伸展蛋白; PAL: 苯丙氨酸解氨酶。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A: major classes of the upregulated cell wall genes in transgenic fibers; B: expression analysis of genes encoding glycoproteins. PRP: proline-rich protein; AGP: arabinogalactan protein; EXT: extensin; PAL: phenylalanine ammonia-lyase. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

*、**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

* and ** mean significant differences at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

4 結論

本研究克隆了一個脯氨酸羥化酶基因, 該基因通過影響基因和糖基轉移酶基因的表達來影響AGP的合成。過表達株系成熟纖維變短與AGP含量增加和糖側鏈組分改變相關, 而RNAi株系成熟纖維長度未發生明顯變化, 可能是由于基因功能冗余導致。推測過表達基因株系出現的表型差異是由AGP糖側鏈組分變化所致,影響棉花纖維發育的分子機制還需進一步研究。

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GhP4H2 encoding a prolyl-4-hydroxylase is involved in regulating cotton fiber development

GAO Lu1,2and XU Wen-Liang1,*

1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology / School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, China;2Wheat Research Institute, Shanxi Agricultural University, Linfen 041000, Shanxi, China

Arabinogalactan proteins (AGPs) perform crucial roles during cotton fiber development, and they are composed of a hydroxyproline (Hyp)-rich core protein and large type-II arabinogalactan (AG) moieties. AGPs are highly glycosylated proteins which involve two most important post-translational processes. First, the proline residues were hydroxylated by prolyl- 4-hydroxylases (P4Hs), then the Hyps were substituted with large arabinogalactan polysaccharides or small arabino- oligosaccharides by glycosyltransferases (GTs). Our previous work had shown that fiber elongation was repressed when-cultured cotton ovules were treated with inhibitors of P4Hs, suggesting that P4Hs were involved in cotton fiber development. In this study,was detected to be relatively highly expressed at fiber elongation stage. Overexpression and RNAi-silencing vectors ofwere constructed and transformed into cotton. Phenotypic analysis showed thatoverexpressing fibers were significantly shorter compared with the wild type from T1generation to T3generation. In addition, AGP content had increased inoverexpression fibers. Immuno dot-blot analysis also showed that carbohydrate moieties of AGP had changed. Moreover, RNA-seq revealed that expression levels of genes encoding hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins including AGPs were enhanced. Overall, these results indicated thatmay regulate fiber development primarily through affecting AGPs composition.

cotton fiber; arabinogalactan proteins (AGPs); prolyl-4-hydroxylase (P4Hs)

10.3724/SP.J.1006.2021.04217

本研究由國家自然科學基金項目(31970516, 31671735)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31970516, 31671735).

許文亮, E-mail: wenliangxu@mail.ccnu.edu.cn

E-mail: 13613418576@163.com

2020-09-22;

2020-12-01;

2020-12-29.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.1747.017.html