小桐子低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子JcDnaJ20p 的克隆及煙草轉(zhuǎn)化功能鑒定

王海波 郭俊云

（曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，曲靖 655011）

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用［1-2］。啟動(dòng)子是功能基因上游負(fù)責(zé)RNA 聚合酶識(shí)別并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的順式作用元件（Cis-acting element），其包含RNA 聚合酶特異結(jié)合所需的保守序列，以及控制轉(zhuǎn)錄精確起始的TATA-box 核心元件與控制轉(zhuǎn)錄頻率的CAAT-box 和GC-box 元件［1］，也可通過(guò)與特定反式作用因子（Trans-acting element）如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)功能基因轉(zhuǎn)錄的速度與頻率［1-3］。根據(jù)基因的表達(dá)方式，啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子（如花椰菜花葉病毒CaMV35S 啟動(dòng)子［4］、水稻肌動(dòng)蛋白ActinI 啟動(dòng)子［5］、玉米泛素Ubiquitin啟動(dòng)子［6］）、組織特異性啟動(dòng)子（如擬南芥韌皮部AtPP2基因啟動(dòng)子［7］、火炬松微管組織PAL基因啟動(dòng)子［8］）、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（如干旱誘導(dǎo)Lea啟動(dòng)子［9］、rd29A啟動(dòng)子［10］、低溫誘導(dǎo)cor15a啟動(dòng)子［11］、高鹽誘導(dǎo)Rab16A啟動(dòng)子［12］、病原誘導(dǎo)SRA啟動(dòng)子［2，13］等）。目前，在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，大部 分 使 用CaMV35S（Cauliflower mosaic virus 35S promoter）作為目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子，作為典型的植物組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，CaMV35S 驅(qū)動(dòng)外源基因在植物中表達(dá)沒(méi)有組織特異性與發(fā)育階段特異性，但會(huì)造成轉(zhuǎn)基因植物由于過(guò)表達(dá)浪費(fèi)大量物質(zhì)與能量，增加代謝負(fù)擔(dān)，甚至改變植物的代謝途徑與外部形態(tài)，從而影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育［14］，而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有逆境誘導(dǎo)表達(dá)特性且不影響植物正常生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，成為培育植物抗逆新品種的最好選擇。

目前，已經(jīng)從多種植物中分離出低溫誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。擬南芥cor15a基因?qū)俚湫偷蜏卣T導(dǎo)表達(dá)基因，其過(guò)量表達(dá)可以顯著提高擬南芥的低溫抵抗能力，同時(shí)該基因的啟動(dòng)子也具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性，能夠在低溫條件下，特異驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)［11］。另外，擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子在植物抗冷基因工程中也有廣泛的應(yīng)用，且由rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株比由CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)影響更小［10］。

能源植物小桐子作為主要的生物柴油植物之一，其種子含油量高，且流動(dòng)性與石化油摻和性好，成為未來(lái)最有可能替代化石能源的潛力樹(shù)種，我國(guó)在“十五”、“十一五”、“十二五”能源發(fā)展綱要中都把發(fā)展小桐子產(chǎn)業(yè)列為可再生能源中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃的重點(diǎn)［15］。小桐子（Jatropha curcasL.）屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹(shù)屬（Jatropha）多年生落葉半肉質(zhì)小喬木或大灌木［16］，目前在我國(guó)滇、黔、川、桂、閩、粵及瓊等省份有較多野生資源分布［17］。小桐子原產(chǎn)中南美洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，低溫冷害是限制小桐子種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素。前期通過(guò)小桐子低溫轉(zhuǎn)錄組［18］與數(shù)字基因表達(dá)譜［19］測(cè)序表明，小桐子低溫條件下高誘導(dǎo)表達(dá)基因主要包括電子傳遞與氧化還原平衡類(lèi)基因、水解酶基因、滲透調(diào)節(jié)物運(yùn)輸家族基因以及轉(zhuǎn)錄因子家族基因，暗示小桐子在響應(yīng)低溫過(guò)程中能量平衡、光合效率、滲透調(diào)節(jié)等功能起重要作用。DnaJ20 蛋白屬于Hsp40 家族分子伴侶，在逆境脅迫下能保護(hù)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性。DnaJ20基因在12℃低溫處理12、24、48 h 下上調(diào)表達(dá)都達(dá)到極顯著水平，與小桐子的抗冷性直接相關(guān)，而其啟動(dòng)子是否也具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性還未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆了DnaJ20基因上游2 023 bp 的啟動(dòng)子序列，并通過(guò)GUS基因融合構(gòu)建了pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS 植物表達(dá)載體，進(jìn)而在煙草中瞬時(shí)表達(dá)鑒定了該啟動(dòng)子的低溫誘導(dǎo)特性，旨在為小桐子抗冷性基因工程的研究提供理論與應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用小桐子材料采自云南省元謀縣干熱河谷地區(qū)。遺傳轉(zhuǎn)化受體煙草品種為云煙87。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumdfaciens）菌株EHA105、植物表達(dá)載體pCambia1381Z 由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T 載體、T4 DNA 連接酶、基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程有限公司（TaKaRa）。TaqDNA 聚合酶購(gòu)自TOYOBO 公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas 公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成與測(cè)序由深圳華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小桐子JcDnaJ20p 啟動(dòng)子的克隆及序列分析 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期小桐子數(shù)字基因表達(dá)譜（低溫12℃處理12、24、48 h）數(shù)據(jù)［19］，分子伴侶DnaJ20基因?qū)儆诘蜏馗唔憫?yīng)基因。通過(guò)DnaJ20基 因 的mRNA 序 列（GenBank 登 錄號(hào)：XM_012230104.2）對(duì)小桐子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（JatCur_1.0）進(jìn)行Blast 相似性檢索，獲得該基因起始密碼子ATG 上游2 500 bp 的啟動(dòng)子序列。利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（JcDnaJ20p_C），上游F：5'-ACGCGTCGACCGTTTGAAAGTTTGGAAGG-3'，下劃線表示SalI 酶切位點(diǎn)；下游R：5'-CCCAAGCTTG AGATCATTCCTGCAGTAG-3'，下劃線表示Hind III 酶切位點(diǎn)，菌落PCR 驗(yàn)證引物（JcDnaJ20p_T），上游F：5'-ACGCGTCGACCGTTTGAAAGTTTGGAAGG-3'；下游R：5'-CAAAGGGAAATAATTTCATTG-3'（擴(kuò)增長(zhǎng)度284 bp）。

采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取小桐子葉片基因組DNA。以基因組DNA 為模板，使用高保 真DNA 聚 合 酶KOD FX Neo DNA Polymerase 及JcDnaJ20p_C 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)，68℃后延伸5 min。將擴(kuò)增片段切膠回收后與克隆載體pMD18-T 連接，命名為pMD18-T-JcDnaJ20p，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂LB 抗性平板（包含50 mg/L Amp），過(guò)夜生長(zhǎng)。利用引物JcDnaJ20p_T 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆，送檢測(cè)序并提取重組質(zhì)粒。測(cè)序序列 通 過(guò)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行鑒定。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD18-TJcDnaJ20p 質(zhì)粒與植物表達(dá)載體pCambia1381Z 經(jīng)SalI、Hind III 雙酶切，切膠回收后利用T4 DNA 連接酶16℃過(guò)夜連接，將小桐子啟動(dòng)子JcDnaJ20p序列克隆至pCambia1381Z 的多克隆位點(diǎn)，獲得JcDnaJ20p 啟動(dòng)子與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB 抗性平板（含50 mg/L 的Kan），37℃過(guò)夜生長(zhǎng)，提取重組質(zhì)粒，通過(guò)SalI 與Hind III 雙酶切進(jìn)行鑒定。同時(shí)構(gòu)建CaMV35 啟動(dòng)子與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCambia1381Z-35S-GUS，將pCambia1381ZJcDnaJ20p-GUS、pCambia1381Z-35S-GUS 融合載體與pCambia1381Z-GUS 空質(zhì)粒通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105 菌株。

1.2.3 煙草轉(zhuǎn)化及GUS 組織化學(xué)染色 將以上轉(zhuǎn)化了不同載體的農(nóng)桿菌菌株挑取單克隆于1 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L Rif 與50 mg/L Kan），28℃震蕩培養(yǎng)24 h。將過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)至25 mL LB 液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L Rif 與50 mg/L Kan），加入100 μL 0.5 mol/L 2-（N-嗎啉）-乙磺酸（2-N-morpholino ethane sulfonic acid，MES），28℃震蕩培養(yǎng)至OD 值約為1.0，4 000 r/min 離心15 min，棄上清，用10 mmol/L MgCl2重懸菌體至OD 值約為1.0，靜置3 h。取正處于生長(zhǎng)期的煙草葉片，用針頭在葉片反面扎數(shù)個(gè)創(chuàng)傷孔，將轉(zhuǎn)化pCambia1381ZJcDnaJ20p-GUS 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液通過(guò)注射器注入葉片下表皮進(jìn)行浸染，同時(shí)以轉(zhuǎn)化pCambia1381Z-35S-GUS 與pCambia1381Z-GUS 空質(zhì)粒的農(nóng)桿菌為對(duì)照浸染煙草葉片。將以上浸染的煙草葉片分別置于15、4℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理24 h，室溫25℃為對(duì)照，之后進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色。將煙草葉片置于GUS 染液（購(gòu)自Coolaber 公司）室溫下染色1 h，用70%乙醇進(jìn)行脫色，每次1 h，重復(fù)4 次，拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 小桐子JcDnaJ20p啟動(dòng)子的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank 中發(fā)表的小桐子基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到JcDnaJ20基因起始密碼子上游2 023 bp 的啟動(dòng)子DNA 片段，命名為JcDnaJ20p（圖1-A）。pCambia1381Z 是包含標(biāo)記基因GUS的啟動(dòng)子功能分析專(zhuān)業(yè)植物表達(dá)載體，雙酶切-T4 DNA 連接酶法構(gòu)建了JcDnaJ20p 啟動(dòng)子與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS（圖2），通過(guò)農(nóng)桿菌菌落PCR（擴(kuò)增長(zhǎng)度284 bp）（圖1-B）與SalI、Hind III 雙酶切驗(yàn)證（圖1-C）顯示，pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS 已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 菌株，同時(shí)提取陽(yáng)性菌落的重組質(zhì)粒（圖1-D）并送樣進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的JcDnaJ20p 啟動(dòng)子序列與小桐子基因組中的序列相似性為99.8%（圖3-D）。

2.2 小桐子JcDnaJ20p啟動(dòng)子的序列分析

根據(jù)Wu 等［20］構(gòu)建的小桐子基因組高密度遺傳連鎖圖譜，通過(guò)Scaffold 數(shù)據(jù)在染色體水平定位JcDnaJ20基因，并使用MapChart 軟件進(jìn)行可視化繪圖顯示，小桐子JcDnaJ20基因定位7 號(hào)染色體（總長(zhǎng)度131.4 cM）的9.7 cM（圖3-A）。進(jìn)一步通過(guò)基因組數(shù)據(jù)分析顯示，小桐子JcDnaJ20基因（GenBank登錄號(hào)：105644672）長(zhǎng)度為894 bp，包含1 個(gè)外顯子（618 bp），在基因兩端還鑒定到長(zhǎng)度分別為82 bp、194 bp 的5'-UTR、3'-UTR 區(qū)域（圖3-B）。

圖1 小桐子JcDnaJ20p 啟動(dòng)子的克隆

圖2 小桐子JcDnaJ20p 啟動(dòng)子與GUS 基因融合植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PlantCARE 工具分析克隆的JcDnaJ20p 啟動(dòng)子序列存在的順式作用元件。結(jié)果表明，該啟動(dòng)子具有真核生物典型的核心啟動(dòng)子序列，包含31 個(gè)CAAT-box 和87 個(gè)TATA-box。另外，還鑒定到激素類(lèi)的響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，核心序列ACGTG）、赤霉素響應(yīng)元件（P-box，核心序列CAAAAGG），以及非生物脅迫類(lèi)響應(yīng)元件，如低溫/脫水響應(yīng)元件（DRE，核心序列ACCGAGA）（圖3-C）。還包括MYB、MYC 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別（CAACGG）與 結(jié) 合（CAACAG） 序列，MYBHv1 結(jié)合元件（CCAAT-box，核心序列CAACGG），從而具備與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)互作的通路，同時(shí)，具有多個(gè)光信號(hào)響應(yīng)元件（ATC-motif，核心序列AGTAATCT；GT1-box，核心序列GGTTAA；Gap-box，核心序列CAAATGAA；TCCC-motif， 核心序列TCTCCCT；TCT-motif，核心序列TCTTAC）（圖3-D）。另外，通過(guò)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載JcDnaJ20基因上游5000 bp 啟動(dòng)子序列，與克隆的2 023 bp 序列相似性為99.8%，且在克隆序列的上游鑒定到更多的與防御、脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件（TC-rich repeats，核心序列GTTTTCTTAC）。

圖3 小桐子JcDnaJ20p 啟動(dòng)子順式作用元件的分析

2.3 煙草葉片GUS活性的組織化學(xué)染色

以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pCambia1381Z-GUS、35S啟動(dòng)子融合GUS的載體pCambia1381Z-35S-GUS 為對(duì)照，將pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS 重組載體采用農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草葉片，之后以常溫25℃為對(duì)照，分別置于15、4℃經(jīng)過(guò)低溫處理24 h 后進(jìn)行GUS 染色。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pCambia1381Z-GUS 的煙草葉片，由于缺乏啟動(dòng)子，GUS報(bào)告基因在3 個(gè)溫度下都沒(méi)有表達(dá)，而轉(zhuǎn)化pCambia1381Z-35S-GUS 的煙草葉片在3 個(gè)溫度下都檢測(cè)到GUS表達(dá)活性，但染色深度基本一致，與35S 啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子的特性一致。另外，轉(zhuǎn)化pCambia1381Z-JcDnaJ20p-GUS 的煙草葉片在3 個(gè)溫度下也都表現(xiàn)出GUS表達(dá)活性，且隨著溫度的降低，表達(dá)量逐漸升高，GUS 染色的顏色也逐漸加深（圖4），表明小桐子JcDnaJ20p 啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子活性，且屬于低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草葉片的GUS 組織化學(xué)染色

3 討論

功能基因啟動(dòng)子區(qū)域的不同順式作用元件決定了該基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，小桐子JcDnaJ20基因啟動(dòng)子區(qū)除了具有真核生物典型核心啟動(dòng)子元件CAAT-box 和TATA-box 外，也鑒定到低溫、干旱響應(yīng)DRE 元件（Dehydration Responsive element），文獻(xiàn)報(bào)道，DRE 順式作用元件普遍存在于干旱、高鹽、低溫脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中［10-11］，說(shuō)明其可能參與小桐子抗冷性與抗旱性的脅迫響應(yīng)過(guò)程。同時(shí)，還鑒定到參與多種脅迫調(diào)節(jié)的MYB元件、MYC 元件。如擬南芥抗逆rd（Responsive to drought）系列基因都包含MYB 元件［21］，另外，擬南芥低溫誘導(dǎo)CBF系列基因都包含MYC 元件［22］，暗示JcDnaJ20基因及其啟動(dòng)子在小桐子抗冷性及其他抗逆性響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，成為未來(lái)小桐子轉(zhuǎn)基因研究的主要候選功能基因。

植物逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)下游調(diào)控基因只在逆境脅迫條件下才誘導(dǎo)其表達(dá)，避免過(guò)量表達(dá)浪費(fèi)植物的物質(zhì)與能源而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育障礙［1-3，14］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子已有一些報(bào)道。cor15a作為典型的低溫誘導(dǎo)基因，其過(guò)量表達(dá)能顯著提高擬南芥的低溫抵抗能力，同時(shí)cor15a基因啟動(dòng)子也具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性［11］。將該啟動(dòng)子與GUS標(biāo)記基因構(gòu)建融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化馬鈴薯表明，經(jīng)過(guò)低溫處理的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片都檢測(cè)到GUS 產(chǎn)物，而未經(jīng)低溫處理的對(duì)照組則未檢測(cè)到GUS 活性［23］。低溫冷害誘發(fā)的次級(jí)水分脅迫也被認(rèn)為是冷害的主要原因之一，在擬南芥rd29A啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到干旱、低溫及高鹽脅迫響應(yīng)的順式作用元件［10］。Kasuga 等［24］將組成型啟動(dòng)子CaMV35S 與低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)的CBF基因在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)出較野生型對(duì)照組更強(qiáng)的抗冷性，且由rd29A驅(qū)動(dòng)的CBF轉(zhuǎn)基因植株比CaMV35S 驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更弱的生長(zhǎng)抑制。另外，擬南芥ADH 啟動(dòng)子［25］、LT178 啟動(dòng)子［26］、CBF2 啟動(dòng)子［27］，小麥mwcs120 啟動(dòng)子［28］，水稻Tdcor39 啟動(dòng)子［29］及大麥blt4.9 啟動(dòng)子［30］也都表現(xiàn)出低溫誘導(dǎo)特性，DnaJ20基因是小桐子低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)較顯著的基因，屬于分子伴侶DnaJ基因家族，煙草瞬轉(zhuǎn)及低溫誘導(dǎo)表達(dá)證明，該基因啟動(dòng)子能夠提高GUS基因的表達(dá)量，具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性。本研究對(duì)深入理解低溫脅迫下DnaJ基因家族的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)小桐子抗冷育種的研究積累了潛在基因資源。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，DnaJ20基因是小桐子低溫誘導(dǎo)高表達(dá)基因。本研究克隆到小桐子DnaJ20基因上游2 023 bp 的啟動(dòng)子序列，PlantCARE 分析表明，該啟動(dòng)子中包含低溫脅迫等響應(yīng)元件。同時(shí)，成功構(gòu)建了該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體，通過(guò)煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)顯示，該啟動(dòng)子能夠顯著提高GUS基因的表達(dá)量，具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性。