基于蛋白質二級結構熱穩定性的正交方法

陳中 盧星宇

（1. 中山大學化學學院，廣州 510275；2. 西湖大學分子科學公共實驗平臺 浙江省功能分子精準合成重點實驗室，杭州 310024）

蛋白質是由氨基酸經“脫水縮合”的方式組成的多肽經過折疊形成的具有一定空間結構的物質，是構成生物體的三大基礎物質之一，機體所有重要的組成部分都需要蛋白質的參與。人體內蛋白質都是由20 種氨基酸按不同比例組合而成，但是性質和生物功能各不相同，其原因與蛋白質的空間結構密切相關。確定蛋白質構象最準確的方法是X-射線晶體衍射［1-6］，但對結構復雜、柔性的生物大分子蛋白質來說，得到所需的晶體結構較為困難。二維、多維核磁共振技術能測出溶液狀態下較小蛋白質的構象［3，7-9］，可是對分子量較大的蛋白質的計算處理非常復雜。近十多年來，冷凍電鏡發展迅速，成為蛋白結構解析的利器，在生命科學領域實現了很多重大科學成果的突破［10-12］，然而其價格非常昂貴，機時緊張，需要非常專業的技術人員，尚不足以滿足大量課題組的需求。

通過測量蛋白質的CD 譜，能夠分析和計算出蛋白質大分子的二級結構組成，方法簡單、快捷，廣泛應用在蛋白質折疊，蛋白質構象研究，酶動力學等領域［4-5，13-18］。如圖1 所示，圓二色光譜的遠紫外波段，近紫外波段及可見波段分別可以研究蛋白的二級結構、三級結構及金屬蛋白復合結構的相互作用。通常蛋白質的二級結構都會在CD 譜的紫外區段（180-260 nm）有明顯的信號，主要生色團是肽鏈，這一波長范圍的CD 譜包含了生物大分子主鏈構象的信息。如表1 所示，主要構象包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、P2 結構及無規卷曲。

蛋白質在一定的物理和化學條件（加熱、加壓、脫水、振蕩、紫外線照射、超聲波、強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基硫酸鈉）下，其空間構象容易發生改變而失活，因此研究蛋白的構象和構型變化對其功能和應用有重要的價值。蛋白質的變性作用主要是由于蛋白質分子內部的結構被破壞。天然蛋白質的空間結構是通過氫鍵等次級鍵維持的，而變性后次級鍵被破壞，蛋白質分子就從原來有序的卷曲的緊密結構變為無序的松散的伸展狀結構（但一級結構并未改變）。熱變性是蛋白質變性中最常見的一類現象，圓二色光譜的變溫檢測可以研究蛋白熱變性過程，并通過擬合直接獲取蛋白質的熱變性中點溫度Tm 值和記錄整個熱變性過程，對研究蛋白組分的熱穩定性及在外界環境改變時的變性過程具有重要的科學價值。

本實驗開發一種測定蛋白二級結構熱穩定性的正交方法，以在180-260 nm 范圍內的圓二色全光譜熱變性測試來考察蛋白質構象隨溫度的變化而改變的全過程。同之前的單波長法相比，本方法的操作難度沒有增加，耗時和樣品量保持一致，避免了單波長如何選點的問題，通過一次測量，既觀測了各個波長的圓二色信號隨溫度變化的曲線，也觀測了圓二色光譜在程序升溫過程中的各個溫度點的變化，從而更全面地觀測蛋白質的整體結構熱變性過程，這是單波長法無法觀測到的信息。

圖1 圓二色光譜用于蛋白結構的分析

表1 蛋白二級結構空間構象的CD 譜分析

1 材料與方法

圓二色光譜儀采用英國應用光物理公司Applied Photophysics Ltd 的Chirascan-V100。牛血清蛋白（CAS號：9048-46-8）和血紅蛋白（CAS 號：9008-02-0）來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。配溶液用的純水來自屈臣士純凈水。圓二色光譜檢測用的比色皿的光程為0.5 mm。

2 結果

下面以牛血清蛋白（BSA）和血紅蛋白（HGB）為例，用全光譜正交法來分析蛋白樣品的熱變性過程。

2.1 蛋白熱變性實驗的濃度優化

為了選擇合適的蛋白濃度進行熱變性實驗，配置了從0.01-1 mg/mL 的5 種濃度的蛋白，分別測試它們的吸光度值和CD 值。

如圖2 所示，當蛋白濃度在0.1-0.5 mg/mL 時，吸光度值在0.4-2 左右，此區間是測試CD 譜的合適范圍，對應的CD 譜曲線除強度不同，形狀完全一致。當蛋白濃度低于0.01 mg/mL，曲線已不能準確看出蛋白結構。當蛋白濃度在1 mg/mL 的量級上，其吸光度在3.5 左右，吸光度值過高導致圓二色光譜不能準確檢測，在CD 譜上可見180 nm 附近的曲線方向與其他3 個稍有不同。將有CD 信號的4 個濃度的蛋白進行熱變性實驗。同時監控它們的吸光度和CD 譜曲線的變化。

圖2 BSA 蛋白的不同濃度的吸光度（A）和圓二色光譜（B）

通過圖3 的吸光度曲線分析，可以看出BSA蛋白的吸光度在0.1 mg/mL 和0.25 mg/mL 時隨著溫度的升高變化較小，在0.5 mg/mL 時變化較大，而1 mg/mL 時變化明顯。圖4 的CD 譜曲線表明當蛋白濃度小于1 mg/mL 時，蛋白的熱變性趨勢接近一致，而1 mg/mL 的蛋白由于吸光度較大，CD 譜曲線在高吸光度區域出現大幅度震蕩的噪音信號，顯示其不是適于進行蛋白二級結構的檢測的合適濃度，所以測試蛋白的熱變性過程的濃度在0.1-0.5 mg/mL為宜。

2.2 蛋白熱變性構象的軟件分析

當測完一組蛋白的熱變性實驗后，通過Global3熱力學分析軟件，如圖5 的每一個圖都有6 個窗口，從左上方到右下方可以得到以下信息：（1）每個波長的圓二色變溫曲線；（2）特征溫度點的圓二色圖譜（如起始圖譜、變性中點溫度的圖譜）；（3）溫度-波長CD 三維圖；（4）計算出的濃度分布作為溫度的函數；（5）噪音三維圖；（6）計算出的熱力學參數（Tm 值和構象的焓變）。前5 個窗口根據每個波長的變溫曲線，逐步計算出此蛋白的Tm值，同時也證實此分析結果的可靠性發現，3 種適合濃度BSA 的Tm 值都在65.5℃；所以只要吸光度在合理的區間（0.2 ＜ A ＜ 3），Tm 值不受濃度的影響。

圖4 BSA 蛋白4 種濃度熱變性的CD 譜

圖5 Global3 軟件分析BSA 蛋白3 種濃度熱變性結果

除了熱變性分析軟件，使用CDNN 軟件做蛋白構象的擬合分析，從蛋白熱變性過程的圓二色譜中的選取3 個溫度的波長曲線：起始溫度點（20℃），中間溫度點（56℃）和最終溫度點（96℃），用軟件計算其蛋白的二級結構。圖6 的結果可以看到，BSA 蛋白最初的狀態是螺旋態為主，隨著溫度的逐漸升高，CD 譜的強度下降，螺旋結構向轉角和無規卷曲逐漸變化，具體表現為構象從α 螺旋向β 轉角和無規卷曲轉化，說明隨著溫度的上升，蛋白構象的總體變化是一個從有序到無序的過程，最終無規卷曲所占的比例最大。

圖6 BSA 蛋白構象CDNN 軟件分析結果

2.3 其他蛋白的熱變性測試分析

除了BSA 蛋白外，還用血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）進行熱變性實驗，根據上述測試結果，血紅蛋白的濃度選用0.25 mg/mL 進行測試。

測試結果如圖7 所示，相比于BSA 血清蛋白，血紅蛋白的熱變性過程更加明顯，當溫度在96℃時，蛋白的CD 信號非常微弱，劇烈的熱變性過程表明此蛋白對于溫度變化更加敏感。從圖8 的Global 3軟件可以分析出此血紅蛋白的Tm 值55.9℃，略低于前面的血清蛋白，也說明血紅蛋白的熱穩定性相對血清蛋白較低。圖9 的CDNN 的分析結果與血清蛋白類似，隨著溫度上升，同樣是發生從α 螺旋向β 轉角和無規卷曲的構象轉化。

2.4 單波長測試對比

作為對比，采用單波長法重復上面的實驗。以BSA（0.25 mg/mL）為例，進行一組蛋白熱變性單波長法的測試。如圖10 和表2 所示，根據全譜曲線選出3 個極值點（191 nm、208 nm、222 nm），一個隨機點（235 nm），一個端點（260 nm）和一個特殊的交叉點（203 nm），分別做6 個單波長蛋白熱變性曲線。數據經擬合圖10 所示，在所有的極值點的Tm值都在65-66℃，中間隨機點也在65-66℃，端點有兩個值分別在的在54℃和80℃附近，特殊交叉點在52℃左右。所以單波長測試與選取的波長位置有很大關系，選取的3 個極值點的結果都是一致的，與全譜所測的Tm 值基本一致，因為極值點反應的是蛋白構象對溫度最敏感的部分，中間任意點只要有足夠的變化，也能正確反應熱變性的過程，只有變化特別小的特殊點和幾乎不變化的端點會給出錯誤信息（擬合的曲線方程不相同），所以采用單波長測試時宜選擇變化大的點更能反應蛋白結構穩定性的真實信息。

圖7 血紅蛋白熱變性測試結果

圖8 Global3 軟件分析HGB 蛋白熱變性的結果

3 討論

蛋白質的熱穩定性探索是研究蛋白功能及開發新藥物的一個重要環節。相比于復雜昂貴的核磁、XRD 及冷凍電鏡，圓二色光譜是一種相對簡單的手段，在研究蛋白質折疊，蛋白質構象領域非常必要，不同于傳統的單波長法，熱變性過程中只求得蛋白的Tm 值信息，效率非常低下。本研究成功構建了蛋白二級結構的正交方法，追蹤各個溫度下的蛋白結構變化過程，覆蓋了蛋白熱變性過程中的非常全面的信息。

本實驗首先通過4 組濃度梯度的測試，優化出蛋白的熱變性過程的適宜濃度為0.1 mg-0.5 mg。從蛋白的熱變性全譜中，選取了BSA 蛋白變溫過程中的3 組曲線，發現蛋白的構象從α 螺旋向β 轉角和無規卷曲轉化，說明隨著溫度的上升，蛋白構象的總體變化是一個從有序到無序的過程，最終無規卷曲所占的比例最大。用HGB 進行重復實驗得到相似的實驗結果，充分證明了實驗設計的可靠性。這些分析結果是用熱變性單波長法無法實現的。此外，這種全譜測試方法，在藥物開發如生物類似藥Biosimilar 的開發過程中，可以同步觀測生物類似藥與參比藥物的結構變化過程的一致性，非常適合于藥物篩選。

為了驗證本方法所測試Tm 值的可靠性，將相同的BSA 蛋白用單波長法分別進行蛋白熱變性的6組實驗發現，當波長取在極值點和變化大的點所測試的Tm 值結果和全譜法完全一致，而波長取在變化小的端點和交叉點與本研究結果差別較大，而且擬合曲線也不正常。所以相比于單波長，本方法既不需要對波長的選取有任何顧慮，又綜合了熱變性過程中所有的結構變化的信息，所得的分析結果也是最全面，最準確的。

圖9 HbC 蛋白構象CDNN 軟件分析結果

4 結論

本實驗基于蛋白的熱穩定性測試開發了一種全光譜的正交方法，通過與單波長法的對比，我們發現當吸光度在合理的范圍內，兩種方法都能正確地測試出蛋白的熱變性溫度（Tm 值），且Tm 值不受濃度的影響。全光譜法測試所花的時間和單波長法測試的時間是一樣的，單波長測試觀測某一特定波長的變化，所得的信息有限；而全光譜法能反應蛋白在所有波長段的熱穩定性狀況，所得的結構信息更完整，包括各種螺旋、折疊結構等隨溫度的變化情況，有利于了解蛋白質的二級結構的整體熱變性過程，將對蛋白藥物的穩定性監控和藥物篩選提供更全面信息。

圖10 六個代表性點的熱變性過程的溫度-CD 強度圖

表2 六個代表性點的熱變性過程的溫度-CD 強度的擬合方程和擬合結果