黃連肉桂對自發性2型糖尿病小鼠膽汁酸代謝、腸上皮Occludin蛋白表達及小腸形態結構改變的影響

穆國華 趙宗江 孟繁章 趙進喜

2型糖尿病(Type 2 Diabetesmellitus，T2DM)近幾年逐漸成為危害我國人民健康的主要慢性代謝性疾病之一，發病率逐年上升且年齡呈下降趨勢。全球約4.15億的糖尿病患者中，約有90%為T2DM，做為人口大國的我們亦是T2DM發病最多的國家之一[1]。近幾年來研究發現，膽汁酸(bile acids，BA)的代謝與T2DM的防治有著密不可分的關系，其可參與糖脂的代謝，其主要機制與BA可以激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor，FXR)進而促進成纖維細胞生長因子19(fibroblast growth factor 19，FGF19)分泌以及活化G蛋白偶聯膽汁酸受體5(G protein cooupled bile acid receptor 5，TGR5)促進腸道L細胞分泌胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)有關[2-3]。腸道的選擇性屏障與代謝性疾病的發生緊密相連，對維持人體代謝平衡起著重要的作用[4-5]。Occludin蛋白對腸上皮緊密連接至關重要，Occludin蛋白缺失引起腸道黏膜破壞，研究證實，T2DM伴隨著腸道腸屏障功能的損害，而腸道完整性由緊密連接控制[6]。

T2DM屬于中醫“消渴病”的范疇，明何柏齋《醫學管見》提出消渴的病機為“造化之機，水火而已，……交則為既濟，不交則為未濟。消渴證，不交而火偏盛也”，此理論為黃連、肉桂治療T2DM提供了有力的理論基礎。研究證實，黃連、肉桂可以有效的改善糖尿病的高血糖狀態，改善胰島細胞功能，延緩糖尿病的并發癥發病進程[7-8]。本實驗研究黃連肉桂是否通過調節自發性2型糖尿病(diabetes mouse，db/db)小鼠膽汁酸代謝及上調腸Occludin蛋白的表達改善腸道屏障功能，降低小鼠血糖及改善胰島素抵抗狀態，為其進一步臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

6周齡SPF級雄性自發性2型糖尿病db/db小鼠(C57BLKS)30只以及6只同周齡雄性同窩野生型db/m小鼠(購自常州卡文思實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(蘇2016-0010)，db/m小鼠體重20～25 g，db/db小鼠體重35～40 g，于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所SPF級動物房飼養。

1.2 藥物及試劑

二甲雙胍片，規格0.5 g×20片，商品名：格華止，購自中美上海施貴制藥有限公司。黃連、肉桂為中藥配方浸膏：黃連及肉桂購自北京康美制藥有限公司，由北京中醫藥大學科研實驗中心進行含量測定，并制成浸膏，均符合2010版藥典合格標準。

1.3 儀器

血糖試紙：穩豪型血糖試紙，產品標準證號：YZB/USA 0659- 2010,強生(上海)醫療器材有限公司。1.8 mL外旋凍存管，購自corning公司。50 mL離心管，購自corning公司。磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒(DP712)，購自TIANGEN公司；血糖儀：強生穩豪型血糖儀(ONETOUCH UltraEasy),強生(上海)醫療器材有限公司。高速冷凍離心機：安徽中科中佳，型號KDC-140HR；分析儀：Thermo公司Q exactive高分辨質譜檢測系統，配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站。

1.4 分組

所有小鼠按3只/籠，飼養于獨立通氣籠系統內，室溫(24±2)℃，12小時光照維持，晝夜循環，自由攝食、飲水。普通飼料適應性喂養1周后，測量db/db糖尿病小鼠尾尖靜脈血糖，選取3次空腹血糖平均值>13 mmol/L[9](禁食6小時，間隔1天)的db/db小鼠30只，隨機分為模型組、二甲雙胍組、黃連組、肉桂組及黃連肉桂組，每組6只；以同齡的db/m小鼠6只作為空白對照組。

1.5 給藥方法

中藥干預藥物為黃連、肉桂，西藥干預藥物為二甲雙胍。以上藥物的成人劑量為二甲雙胍1500 mg/60 kg，黃連∶肉桂=10∶1，小鼠劑量的換算方法參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》，人和動物間按體表面積對劑量進行換算：小鼠劑量(mg/kg)=9.1×人的臨床劑量(mg/kg)。采取灌胃的方式進行給藥，空白組及模型組仍給予純凈水，適應性飼養1周后，開始藥物干預，藥物干預時間為8周。

1.6 指標檢測

1.6.1 血糖及胰島素檢測 在第8周時，采用血糖儀測定尾靜脈血，記錄小鼠血糖水平；最后摘除眼球取血離心，生化法測定小鼠空腹胰島素水平。

1.6.2 液相色譜法檢測小鼠膽汁酸代謝情況 采用提尾反射法收集小鼠糞便標本，使用無菌EP管收集標本，每管采集3粒糞便，標記后放入-80℃低溫冰箱保存，經過樣品提取純化后，基于液相色譜分析法分析各組小鼠糞便中不同的BA含量。

1.6.3 蛋白免疫印跡法檢測小鼠回腸Occludin蛋白量的表達 取3只小鼠少量超低溫冰箱中的小鼠回腸粉碎組織加入RIPA裂解液勻漿后裂解,隨后于4℃冷凍離心機下12000 r/min離心10分鐘，取上清液使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，對蛋白進行變性，制備SDS-PAGE上樣緩沖液，經電泳、轉膜、抗體孵育、化學發光、顯影后，采用目的條帶與內參蛋白條帶光密度比值作為結果進行統計分析。

1.6.4 電鏡觀察小鼠小腸超微結構改變 取少量小腸組織，室溫下新鋨酸固定2小時，蒸餾水沖洗3次，2分鐘/次，后經果脫水、包埋，超薄切片后于透射電鏡下觀察小腸黏膜超微結構的改變。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 黃連肉桂對db/db小鼠血糖、胰島素監測

藥物干預前，db/db小鼠各組的血糖無統計學差異(P>0.05)，在第8周分別對各組小鼠的血糖進行檢測，對第8周各組小鼠的血糖進行分析，模型組小鼠血糖明顯高于其他組(P<0.05)，黃連組與黃連肉桂組小鼠血糖值明顯優于雙胍組(P<0.05)，中藥各組相比黃連、黃連肉桂組小鼠血糖值優于肉桂組(P<0.05)。正常組空腹胰島素明顯低于其余各組小鼠(P<0.05)，雙胍組、黃連組、黃連肉桂組小鼠空腹胰島素均明顯低于模型組(P<0.05),且三組中黃連肉桂組空腹胰島素均值最低。如表1所示。

表1 黃連肉桂對各組db/db小鼠第8周血糖及胰島素情況鼠只=6)

2.2 黃連肉桂對db/db小鼠膽汁酸代謝影響

用藥組中，肉桂組膽酸(cholic acid，CA)含量較正常組及模型組明顯升高(P<0.05)，黃連肉桂組CA含量較正常組及模型組明顯升高(P<0.05)；各組小鼠代謝中鵝去氧膽酸(chenodeoxy cholic acid，CDCA)含量相比，黃連肉桂組較模型組明顯升高(P<0.05)；熊去氧膽酸(Ursodeoxy cholic acid，UDCA)在各組小鼠糞便中含量相比較，黃連組比模型組明顯下降(P<0.05)，黃連肉桂組較模型組及雙胍組明顯降低(P<0.05)。如表2所示。

表2 黃連肉桂對各組小鼠不同膽汁酸代謝情況(鼠只=6，ng/mg)

2.3 黃連肉桂對db/db小鼠腸Occludin蛋白表達的影響

與正常組對比，模型組Occudin含量明顯減少(P<0.05),黃連肉桂組與模型組相比Occudin含量明顯明顯增加(P<0.05)，雙胍組Occudin含量較正常組及黃連肉桂組明顯減少(P<0.05)。余各組間無明顯統計學差異。如圖1、表3所示。

圖1 各組小鼠腸組織Occludin蛋白表達情況

表3 蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠腸Occludin蛋白表達情況(鼠只

2.4 黃連肉桂對各組小鼠腸道超微結構改變

正常組小鼠腸黏膜表皮微絨毛排列均勻整齊，邊界清晰，長度一致，無不規則脫落情況，細胞無明顯改變，細胞間隙均勻，大小正常。模型組小鼠腸粘膜表皮微絨毛排列稀疏、邊界欠清，長短不一，形態不規則，有脫落融合現象，腸黏膜上皮細胞間緊密連接間隙增寬，結構模糊，說明腸黏膜緊密連接的超微結構被破壞。三組中藥組小鼠腸黏膜結構清晰完整，微絨毛排列整齊、形態正常，大小均勻且連接緊密，其中黃連肉桂組排列較其他兩中藥組及模型、雙胍組更為緊密均勻，細胞內外結構更為完整，細胞間隙均勻，大小正常，腸黏膜緊密連接的超微結構較為完整，與正常組最為接近。如圖2所示。

圖2 掃描電鏡下各組小鼠小腸超微結構的改變

3 討論

黃連味苦性寒，歸心、胃、肝、大腸經，其主要功效為清熱燥濕、瀉火解毒，肉桂辛、甘、熱，歸心、肝、脾、腎經，具有補火助陽、散寒止痛、溫經通脈和引火歸源的功效，王好古謂其“補命門不足，益火消陰”；兩者配伍，一上一下，一寒一熱，下可溫補腎陽、引火歸原，上可瀉火解毒、益陰清熱。近幾年，諸多研究證實黃連肉桂同用可以有效的改善T2DM患者高血糖狀態，改善胰島細胞功能，延緩糖尿病的并發癥發病進程[10]?，F代藥理學研究證實，黃連素及油桂皮醛均具有抗潰瘍、止瀉、促進胃腸蠕動及促進膽汁分泌等功效,且兩者配伍后降糖效果明顯[11-12]。黃連肉桂用于T2DM的治療有著充分的中醫學理論依據和藥理學研究基礎。

BA的代謝與T2DM的關系是目前研究的熱點，BA在人體肝臟中主要由膽固醇在肝細胞中通過復雜的類固醇羥基化及側鏈氧化步驟而合成，BA主要通過經典途徑、替代途徑兩條途徑生成，分別產生CA和CDCA，在小鼠體內同時還可以產生鼠膽酸(muricholic acid，MCA)和UDCA作為主要膽汁酸[13-15]。BA參與糖脂代謝的調節，主要是通過FXR和TGR5來實現[16]，FXR可以促進細胞生長因子成纖維生長因子15/人直系同源19(fibroblast growth factor 15/19，FGF15/19)的分泌，BA-FXR介導的腸FGF15/19與肝成纖維細胞生長因子受體4/可羅索β蛋白結合，從而促進肝糖原合成和降低血糖，同時還可以減輕T2DM小鼠的體重增加、葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗[17]，TGR5可以促進腸道L細胞分泌GLP-1來調節血糖[18]。本實驗研究顯示，黃連肉桂可以促進db/db小鼠CA和CDCA的分泌，同時減少UDCA的含量，有研究證實，不同BA對FXR的激活作用不盡相同，CDCA是FXR最有效的膽汁酸配體，CA次之[19]，而UDCA對FXR受體具有拮抗作用[20]。

腸道屏障的完整性與人體的健康關系密切，腸道屏障的損傷可以引發諸多炎性因子及內毒素入血，進而導致許多代謝疾病的發生，腸道通透性改變，可以激活導致胰島素抵抗的全身性炎癥反應繼而誘導T2DM的發生[21]。T2DM患者常伴有腸道完整性的損害，腸道屏障的完整性是否完好取決于緊密連接控制[22]，而緊密連接是由跨膜蛋白和胞質蛋白組成，Occludin蛋白為其中之一，Occludin蛋白是最早被發現的跨膜緊密連接蛋白[23]，研究證實，Occludin蛋白的丟失可以導致腸上皮緊密連接滲透通路的通透性增加，損害腸道屏障[24]。此次試驗中，黃連肉桂可以有效提高db/db小鼠腸道Occludin蛋白的表達改善小腸通透性，提高小腸屏蔽功能。

本實驗再次通過檢測db/db小鼠的血糖、空腹胰島素、膽汁酸代謝、腸道Occludin蛋白的表達及其對小腸形態結構的改變，探討黃連肉桂改善db/db小鼠高血糖狀態的作用機制，實驗研究顯示，黃連肉桂可以有效改善db/db小鼠高血糖狀態，減少db/db小鼠空腹胰島素分泌，其機制可能與其可以調節膽汁酸代謝、增加腸道Occludin蛋白表達改善腸道通透性有關，為黃連肉桂在臨床的進一步應用提供了實驗數據支持。