大麥籽粒β-葡聚糖含量的全基因組關聯分析

耿 臘 黃業昌 李夢迪 謝尚耿 葉玲珍,3,* 張國平

大麥籽粒β-葡聚糖含量的全基因組關聯分析

耿 臘1黃業昌2李夢迪1謝尚耿1葉玲珍1,3,*張國平1

1浙江大學作物科學研究所, 浙江杭州 310058;2溫州科技職業學院, 浙江溫州 325000;3浙江大學新農村發展研究院, 浙江杭州 310058

β-葡聚糖是大麥籽粒的一個重要品質性狀, 其含量高低影響大麥啤用、飼用和食用品質。雖然有關大麥β-葡聚糖合成的相關基因已有報道, 但關于大麥籽粒β-葡聚糖積累的遺傳調控機制仍不十分清楚。本研究以前期收集的全球119份大麥基因型為材料, 種植在土壤與氣候條件有一定差異的兩試點, 利用混合線性模型(MLM)和一般線性模型(GLM)對不同大麥材料籽粒β-葡聚糖含量進行GWAS分析。結果表明, 大麥籽粒β-葡聚糖含量的基因型差異顯著, 其在2個環境下的廣義遺傳力為73.9%。利用MLM和GLM模型分別檢測到8個和40個顯著位點, 合并2個模型重疊位點后共得到44個顯著位點, 其中基因在2個模型、2個地點均被鑒定到, 故被認為是與β-葡聚糖含量顯著相關的候選基因。2個模型中最佳等位基因數與β-葡聚糖含量均呈顯著正相關。此外, 基于基因注釋, 共鑒定到10個與糖合成、轉運及分解相關的酶類基因, 這些基因可能與籽粒中β-葡聚糖的合成、積累和分解緊密相關。本研究結果為闡明β-葡聚糖的遺傳調控機制提供了新的視角, 亦為大麥籽粒β-葡聚糖的遺傳改良奠定了一定的理論基礎。

大麥; β-葡聚糖; 全基因組關聯分析; SNP位點; 最佳等位基因

大麥是全球廣泛栽培的主要谷類作物, 且用途多樣, 集飼用、啤用和食用于一體。與水稻、玉米和小麥等其他禾谷類作物相比, 大麥籽粒的化學成分獨特, 其中富含β-葡聚糖是其主要特點之一, 平均含量高于小麥近10倍[1]。β-葡聚糖是大麥籽粒胚乳和糊粉層細胞壁的主要成份, 無論在啤用、飼用還是食用上都是一個重要的品質性狀。用于釀造啤酒時, 大麥籽粒β-葡聚糖會增加麥汁黏度從而影響麥汁的過濾速度, 降低麥芽浸出物產量, 同時還因產生凝膠沉淀作用而使啤酒易發生混濁[2]; 用于飼料原料時, β-葡聚糖會增加非反芻畜禽動物腸液的黏度, 影響食料的消化和吸收, 從而降低飼用價值, 故被認為是畜禽的一種抗營養因子[3-4]。相反, 大麥用于人類食糧時, β-葡聚糖則是一種有益健康因子, 它具有降低血液膽固醇及預防結腸癌、直腸癌的作用[5]。因此, 明確大麥籽粒β-葡聚糖合成的遺傳及其調控基因, 篩選與鑒定相關分子標記, 根據大麥用途調控β-葡聚糖的合成與積累, 對于提高專用大麥品種的品質具有重要意義。

首個發現與大麥β-葡聚糖合成相關的基因是纖維素合成酶類基因()[6]。后續研究顯示, 大麥β-葡聚糖由纖維素合成酶類F()和纖維素合成酶類H ()基因家族成員共同調控合成[7-8]。基因家族是纖維素合成酶基因超家族的一部分, 由位于大麥基因組1H、2H、5H和7H染色體上的10個成員組成[8-9]; 其中基因在決定β-葡聚糖含量中發揮著重要作用。大麥過表達由胚乳特異性啟動子控制的基因可顯著增加籽粒β-葡聚糖含量[10], 而小麥中下調該基因表達可顯著降低籽粒β-葡聚糖含量[11]。雖然大麥β-葡聚糖合成相關的基因已有報道, 但有關大麥籽粒β-葡聚糖積累的遺傳調控機制仍不十分清楚。

近年來, 全基因組關聯研究(genome-wide association study, GWAS)分析作為重要的遺傳解析方法, 已廣泛應用于水稻、玉米和小麥等作物重要農藝性狀的基因鑒定研究[12-14]。在大麥中, 利用這一方法已對籽粒密度[15]、花期[16]、棱型[17]等重要性狀進行過相關研究, 但對籽粒β-葡聚糖等重要品質性狀仍有待于開展更深入和廣泛的研究。本研究擬以119份大麥種質資源(包括西藏半野生大麥、國內栽培品種及國際常見商業品種)為材料, 分別種植在土壤和氣候條件存在一定差異的2個試點, 對籽粒β-葡聚糖含量進行GWAS分析; 旨在獲得與β-葡聚糖含量顯著連鎖的SNP位點, 挖掘其優異等位變異及預測候選基因, 從而為大麥β-葡聚糖的遺傳改良提供理論指導與優異基因資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間試驗

本研究供試大麥材料共119份, 含我國西藏半野生大麥44份、我國栽培品種59份、國外栽培品種16份。所有材料均于2018年11月初播于浙江大學長興農業科學試驗站(CHX)和浙江省慈溪農業科學試驗站(CX)。長興和慈溪的土壤pH分別為6.0和8.29, 全氮含量分別為1.22 g kg?1和1.31 g kg?1, 速效磷含量分別為8.9 mg kg?1和102 mg kg?1, 速效鉀含量分別為12.5 mg kg?1和163 mg kg?1。每份材料種5行, 每行播50粒種子, 行長2 m, 行間距0.25 m。所有農藝管理措施, 包括施肥、除草和病蟲害防治等與當地大田生產相同。大麥成熟時每份材料收中間3行的種子, 干燥后儲存于4℃冰箱備用。

1.2 β-葡聚糖含量測定

大麥種子用旋風磨粉機粉碎, 過40目篩, 密閉儲存。β-葡聚糖按Houston等[18]介紹的方法, 采用Megazyme公司生產的β-葡聚糖試劑盒(K-BGLU 02/17)測定, 每份材料測定重復3次。

1.3 DNA提取和基因型分析

供試大麥材料培養至二葉一心, 取葉片, 采用CTAB法提取全基因組DNA; 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量及濃度。委托澳大利亞Dart公司(https://www.diversityarrays.com/)進行全基因組SNP標記分型。獲得的基因型數據按完整度大于等于0.8, 最小等位基因頻率占有分型樣本比例(Minor Allele Frequency, MAF)大于0.05篩選, 共獲得7287個高質量的SNP位點, 用于后續群體結構、親緣關系以及全基因組關聯分析。

1.4 全基因組關聯分析、候選基因鑒定與基因表達分析

用Structure 2.3.3軟件進行群體結構Q矩陣的計算, 用SPAGeDi計算親緣關系K矩陣。將基因型、表型、Q矩陣和K矩陣導入Tassel 5.0后, 以Q矩陣和Q+K矩陣作為協變量, 分別進行基于一般線性模型(General Linear Model, GLM)和混合線性模型 (Mixed Linear Model, MLM)的全基因組關聯分析。在關聯分析過程中計算獲得每個SNP位點的值和2。將顯著性閾值設置為≤1′10–4和≤1′10–3, 即–log10()≥和–log10()≥3, 使用R軟件將GWAS分析結果繪制成曼哈頓圖和QQ圖。

利用大麥全基因組數據庫, 對GWAS分析所獲的顯著性標記附近提取±100 kb范圍內基因作為候選基因; 進一步在數據庫中提取注釋信息和基因表達譜信息。

1.5 數據分析

采用SPSS軟件進行頻次分布圖制作、相關和方差分析。使用的模型為混合線性模型:=+基因型+環境+基因型×環境+誤差(基因型和環境為固定因子); 遺傳力按2g/[gGL/e/()]估算, 其中g表示品種方差,GL表示地點和品種的互作,e表示殘差的方差組分,為2 (2個地點),為3 (3次重復)。

2 結果與分析

2.1 β-葡聚糖含量的基因型與環境差異

供試的119份大麥材料的β-葡聚糖含量在2個環境中存在顯著的差異, 長興和慈溪點β-葡聚糖含量分別變動于1.66%~5.48%和1.98%~6.49%, 平均含量分別是3.03%和3.39% (圖1)。所有材料在2個環境種植, β-葡聚糖含量的相關系數為0.75 (≤0.001), 達極顯著水平, 且呈正態分布。方差分析表明, 基因型、環境、互作和誤差可分別解釋表型變異的76.46%、8.18%、12.40%和2.96% (表1), 且β-葡聚糖含量在2個環境下的廣義遺傳力為73.9%, 說明大麥籽粒β-葡聚糖含量主要受遺傳控制。

**表示在0.01水平差異顯著。**Significant differences at= 0.01.

表1 119份栽培品種在2個不同環境中的β-葡聚糖含量方差分析

***表示在0.001水平差異顯著。***Significant differences at= 0.001.

2.2 β-葡聚糖含量的全基因組關聯分析

利用MLM模型對2個環境下的β-葡聚糖含量進行全基因組關聯分析, 當閾值為-log10()≥3時, 在長興和慈溪2個環境型中分別檢測到7個和2個顯著位點(圖2和表2), 其中位于5號染色體的標記M-3924095 (標記編號4)在2個環境中均被檢測到。合并重疊的位點后得到8個顯著性位點, 分布在2號~7號染色體, 可解釋13.5%~16.98%的表型變異。

同時, 利用GLM模型對2個環境下的β-葡聚糖含量進行全基因組關聯分析, 當閾值為-log10()≥4時, 在長興和慈溪分別檢測到32個和17個顯著位點(圖3和表3), 其中有9個位點在2個環境中均被檢測到。合并重疊的位點后得到40個顯著性位點, 分布在各條染色體, 可解釋12.24%~22.93%的表型變異。

比較以上2個關聯模型的結果, MLM模型和GLM模型有4個位點重疊, 分別是M-3262394、M-3924095、M-3263056和M-3911599; 合并2個模型的結果, 共得到了44個顯著位點。

A: 長興β-葡聚糖含量MLM曼哈頓圖; B: 慈溪β-葡聚糖含量MLM曼哈頓圖。水平線代表顯著相關的1E-03閾值。

A: Manhattan plot of MLM in CHX; B: Manhattan plot of MLM in CX. The horizontal line depicts the 1E-03 threshold for significant association.

表2 MLM模型下β-葡聚糖含量顯著相關的SNP位點(-log10(P) > 3)

a下畫線表示提高β-葡聚糖含量最佳等位基因。

aFavorable alleles for increasing β-glucan content are underlined. MAF: minor allele frequency.

2.3 最佳等位基因對β-葡聚糖含量的影響

為了明確檢測到的顯著性位點在大麥育種上利用價值, 在此我們引入最佳等位基因。對119份大麥籽粒β-葡聚糖含量和等位基因信息進行方差分析, 可顯著提高β-葡聚糖含量的等位基因視為最佳等位基因(表2和表3)。在MLM模型和GLM模型中, 最佳等位基因的數量分別為0~7和3~30 (附表1), 且與β-葡聚糖含量呈顯著正相關(圖4)。

2.4 候選基因鑒定

在顯著性位點上下游100 kb范圍內尋找候選基因, 基于MLM模型和GLM模型分別鑒定到17個和117個基因, 合并重合基因, 2個模型共鑒定到126個基因(表2和表3)。基因在2個模型、2個地點均被鑒定到, 可認為是和β-葡聚糖含量顯著相關的候選基因。該基因的注釋信息為MYB21轉錄因子。此外, 基于基因注釋, 共鑒定到10個與糖合成、轉運及分解相關的酶類基因, 這些基因可能與籽粒中β-葡聚糖的合成、積累和分解緊密相關。結合基因轉錄表達信息, 發現這些候選基因在大麥不同組織和不同發育時期均有表達(圖5和附表2); 在后續研究可通過轉基因或者CRISPR/Cas9敲除, 進一步驗證這些候選基因的功能。

A: 長興β-葡聚糖含量GLM曼哈頓圖; B: 慈溪β-葡聚糖含量GLM曼哈頓圖。水平線代表顯著相關的1E-04閾值。

A: Manhattan plot of GLM in CHX; B: Manhattan plot of GLM in CX. The horizontal line depicts the 1E-04 threshold for significant association.

A: MLM模型結果; B: GLM模型結果。

A: MLM model results; B: GLM model results.

基因在各個生長發育期的轉錄表達值以對數進行標準化后的取值范圍是–2.5~2.5, 紅色表示高表達, 藍色表示低表達, 灰色表示無表達。

For each period, the transcript expression values are calculated as LOG ranged from-2.5 to 2.5. Red blocks indicate high expression, blue indicate low expression, and gray mean no expression.

3 討論

本研究以119份大麥基因型為材料, 種植在土壤和氣候條件存在明顯差異的2個試點, 測定分析籽粒β-葡聚糖含量的基因型與環境差異。結果顯示, 供試的大麥群體中β-葡聚糖含量的基因型差異顯著, 其廣義遺傳力為73.9%, 證明β-葡聚糖含量主要受遺傳控制, 環境條件雖有一定影響, 但作用相對較小[18]。因此, 根據大麥的用途, 通過遺傳改良手段定向調控籽粒β-葡聚糖含量是現實可行的, 也是改善這一品質性狀的有效途徑。

本研究利用2個關聯模型(MLM和GLM)鑒定調控籽粒β-葡聚糖含量的相關基因或位點, 共檢測到44個顯著位點, 分布于7條染色體上。在各個模型下, 兩試點中均有位點重合, 且2個模型之間也有部分位點重合。這些在不同環境或模型下均檢測到的位點, 可視為調控大麥籽粒β-葡聚糖含量的遺傳位點。另外, 發現了可顯著提高β-葡聚糖含量的等位基因, 即最佳等位基因。以上結果可為大麥分子標記輔助育種提供相關信息, 即最佳等位基因數較多的大麥品種, 如藏青320和Ticn, 適用于食用大麥育種; 相反, 那些最佳等位基因數較少的大麥品種, 如崇穗刺毛大麥和崗2, 則適用于飼用或者啤用大麥品種的育種。

國際上已有一些關于大麥籽粒β-葡聚糖含量的關聯和連鎖分析研究[21-22], 結合前人研究結果, 發現本研究中所發掘的位點大多數為新位點。已有大量文獻顯示纖維素合成酶類基因對大麥籽粒β-葡聚糖含量具有顯著效應, 尤其是和[7,10,23]。被認為是調控β-葡聚糖合成的主要基因, 但本研究中未鑒定到該基因。這可能是由于基因在β-葡聚糖合成中十分重要, 其編碼區和啟動子區的核苷酸高度保守[24]; 也有可能是其有效等位基因的比率過低(低于0.05, 被過濾)以及本研究的群體數目和SNP標記密度不夠等原因引起。不過, 類似的大麥β-葡聚糖含量的遺傳定位研究也有未鑒定到該基因的報道[18,25-27]。因此,在大麥β-葡聚糖合成中的作用是否存在基因型依賴性, 值得深入研究。

雖然沒有鑒定到已知與β-葡聚糖合成相關的基因, 但本研究鑒定到一些和糖代謝有關的酶類基因, 主要包括一些與糖轉運和糖降解有關的酶, 它們可能與β-葡聚糖含量存在一定的關聯。有研究表明, 水解酶和轉運酶在決定最終β-葡聚糖含量具有重要作用[28-30]。在β-葡聚糖合成過程中, 轉運酶負責催化糖基化反應[28], 但是水解酶的具體作用尚不清楚, 仍需進一步研究。同時也有報道顯示, 除纖維素合成酶類基因, 一些參與β-葡聚糖組裝的酶類基因也可能對β-葡聚糖最終含量具有顯著影響[31]。

本研究通過對大麥籽粒β-葡聚糖含量的GWAS分析, 其中大多數為新位點, 進一步挖掘到到一些與糖轉運、降解相關的基因, 這與前人關注纖維素合成酶類基因的研究不同, 可為進一步研究β-葡聚糖的遺傳調控提供了新的視角。

4 結論

本文采用GWAS方法, 分別用GLM和MLM兩種模型開展了大麥籽粒β-葡聚糖含量有關的遺傳調控機制解析及優良等位基因鑒定的系統研究, 共鑒定到44個重合位點, 126個候選基因。基于鑒定到的位點穩定性和基因功能注釋, 共鑒定到11個可能與大麥籽粒β-葡聚糖合成、積累和分解緊密相關的酶類基因。該結果對于大麥品質性狀形成和育種實踐具有較好的理論和應用參考價值。

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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Genome-wide association study of β-glucan content in barley grains

GENG La1, HUANG Ye-Chang2, LI Meng-Di1, XIE Shang-Geng1, YE Ling-Zhen1,3,*, and ZHANG Guo-Ping1

1Institute of Crop Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China;2Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325000, Zhejiang, China;3New Rural Development Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

β-glucan is an important trait in barley, as its content greatly affects the quality in the applications of malting, feeding, and food. Although the genes associated with β-glucan synthesis have been reported, genetic regulation of β-glucan accumulation in barley grains is still unclear. In this study, genome-wide association study (GWAS) with mixed linear model (MLM) and general linear model (GLM) was performed to analyze the grain β-glucan content of 119 barley germplasms collected from worldwide previously, which were planted at two plots with certain differences in soil and climate conditions. The results showed β-glucan content in barley grains was significantly different in genotypes and the heritability of β-glucan was 73.9% in two environments. There were eight and 40 loci for grain β-glucan content detected by MLM and GLM, respectively. A total of 44 loci were obtained by combining the same loci of the two models.gene identified in both models and sites was considered as a putative candidate gene significantly associated with β-glucan content. Significantly positive correlation was detected between grain β-glucan content and the number of favorable alleles in both models. In addition, 10 enzymatic genes related to sugar synthesis, transport and decomposition were identified based on gene annotations. These genes may significantly relate to β-glucan synthesis, accumulation and hydrolysis. The results provided a new insight into the genetic regulation of β-glucan accumulation and laid a foundation for the genetic improvement breeding of barley seed β-glucan.

barley; β-glucan; genome-wide association study (GWAS); SNP loci; favorable allele

10.3724/SP.J.1006.2021.01074

本研究由浙江省自然科學基金項目(LGN20C130007), 國家自然科學基金項目(31701411)和國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-05)資助。

This study was supported bythe Science and Technology Program of Zhejiang Province (LGN20C130007), the National Natural Science Foundation of China (31701411), and the China Agriculture Research System (CARS-05).

葉玲珍, E-mail: Yelingzhen@zju.edu.cn

E-mail:21816022@zju.edu.cn

2020-08-23;

2020-12-01;

2020-12-30.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201230.1429.002.html