不同耐旱性青稞葉片差異蛋白分析

李 潔 付 惠 姚曉華 吳昆侖

不同耐旱性青稞葉片差異蛋白分析

李 潔**付 惠**姚曉華 吳昆侖*

青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 / 青海省農(nóng)林科學(xué)院 / 青海省青稞遺傳育種重點實驗室 / 國家麥類改良中心青海青稞分中心, 青海西寧 810016

為從蛋白質(zhì)水平揭示不同青稞品種響應(yīng)干旱脅迫的差異, 分析抗旱蛋白質(zhì)分子機制, 本研究以干旱脅迫不敏感的旱地紫青稞(HDZ)和干旱脅迫敏感的大麻青稞(DM)為研究材料, 以盆栽限量供水種植方法, 對干旱處理不同梯度的青稞葉片進行葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛含量及相對電導(dǎo)率4項生理指標(biāo)的測定, 同時利用iTRAQ技術(shù)對深度干旱脅迫青稞葉片全蛋白組進行差異蛋白分析。結(jié)果表明: 隨著干旱處理時間的延長, 兩種青稞的葉綠素和可溶性蛋白含量逐漸下降, 電導(dǎo)率及丙二醛的含量逐漸升高, 在相同處理條件下, 大麻青稞的葉綠素和可溶性蛋白含量降低幅度、電導(dǎo)率及丙二醛含量的增高幅度明顯高于旱地紫青稞; 對兩個青稞品種的干旱脅迫和正常培養(yǎng)的比較組進行iTRAQ分析, 共定量出4163個蛋白(多肽), 其中旱地紫青稞比較組中對比正常培養(yǎng), 篩選到表達上調(diào)的蛋白68個, 下調(diào)的蛋白63個, 在大麻青稞的比較組中篩選出表達上調(diào)蛋白21個, 下調(diào)蛋白32個。KEGG通路分析表明, 富集程度位于前3位的通路是代謝、氨基酸的生物合成以及次級代謝產(chǎn)物的生物合成, 主要涉及到檸檬酸循環(huán)、碳循環(huán)等代謝通路, 丙氨酸、精氨酸等氨基酸的合成降解以及花生四烯酸、亞麻酸等次級代謝產(chǎn)物的合成。本研究從蛋白組水平篩選了青稞干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的代謝通路和其他相關(guān)功能的蛋白, 為揭示青稞干旱脅迫的應(yīng)答分子調(diào)控機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

青稞; 干旱脅迫; 葉片; 差異蛋白; iTRAQ

干旱是影響面積最廣、危害程度最深的非生物脅迫, 每年因干旱導(dǎo)致作物減產(chǎn)高達50%以上[1]。植物為適應(yīng)干旱環(huán)境, 其葉片、根系等組織感受到脅迫后, 會通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng), 轉(zhuǎn)錄激活、調(diào)節(jié)大量基因及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達, 從而協(xié)助植物得以在逆境中存活[2-4]。因此, 絕大部分基因及其功能有待于在蛋白質(zhì)層面予以揭示和闡述。

青稞(L. var.Hook. f.)屬于禾本科小麥族大麥屬普通大麥種, 因其內(nèi)外穎殼分離, 籽粒裸露, 又稱為裸大麥[5], 是青藏高原等高寒地區(qū)的主要作物。青稞主要種植在高寒缺氧、環(huán)境惡劣的地區(qū), 在長期的適應(yīng)性進化過程中產(chǎn)生了大量的優(yōu)異抗逆基因, 具有耐寒、耐旱、耐瘠薄等優(yōu)異種性[6]。在青海, 青稞種植區(qū)域多在海拔2700 m以上灌溉設(shè)施不能滿足的高寒農(nóng)區(qū)和農(nóng)牧交錯區(qū), 其受旱時期主要發(fā)生在春季及夏季, 嚴(yán)重影響青稞幼苗分蘗的形成與籽粒灌漿, 最終導(dǎo)致籽粒不飽滿以及減產(chǎn)等問題。因此選擇耐旱青稞品種, 可以使廣闊、干旱、貧瘠的土地最大資源化[5,7]。

目前對青稞抗逆基因[8-10]的研究已經(jīng)有了一些報道, 但利用差異蛋白質(zhì)研究方法篩選、鑒定相關(guān)耐旱基因在青稞抗逆研究中應(yīng)用鮮見報道。本研究采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術(shù), 比較兩種對水分脅迫敏感程度不同的青稞在干旱脅迫下葉片蛋白表達的差異, 進行定性定量分析, 旨在從蛋白水平揭示青稞品種間的耐旱差異, 為青稞耐旱研究提供一些方法和手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)之前28個青稞品種干旱脅迫篩選結(jié)果[5], 從中選用敏感與不敏感的2個青稞品種為供試青稞品種, 材料分別為旱地紫青稞(不敏感, HDZ)、大麻青稞(敏感, DM)。

1.2 試驗處理

材料采用玻璃溫室盆栽限量供水種植, 每個花盆中放風(fēng)干土6 kg, 種植前兩天用水將花盆中的土壤澆透。選擇籽粒光滑飽滿的種子播種, 每盆播25粒, 出芽后每盆定苗20株, 溫室溫度22~25℃。待青稞植株長至三葉一心時處理, 設(shè)干旱脅迫與正常供水兩種處理。干旱梯度形成前確保各盆土壤相對含水量基本達到飽和, 然后停止?jié)菜屍渥匀桓珊抵猎O(shè)定標(biāo)準(zhǔn), 每處理重復(fù)3次。在干旱處理第7天(土壤相對含水量為對照的65%)及第10天(土壤相對含水量為對照的45%)上午10:00, 收取長勢一致的植株倒二葉同一部位葉片約0.5 g, 放置于–80℃超低溫冰箱保存。

1.3 生理指標(biāo)的測量

在干旱處理第7天和第10天, 采植株葉片進行葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、相對電導(dǎo)率及丙二醛含量等生理生化指標(biāo)進行測定。葉綠素含量采用丙酮乙醇混合液法測定[11]; 蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測定[12]; 電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀法測定, 以相對電導(dǎo)率(%)表示, 相對電導(dǎo)率= (浸泡電導(dǎo)率值/煮沸后電導(dǎo)率值)×100%, 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[13]。

1.4 葉片總蛋白質(zhì)提取

采用TCA-丙酮沉淀-酚/SDS-聯(lián)合抽提法提取青稞葉片總蛋白[14]。提取樣品為干旱處理第10天2個青稞的葉片及正常培養(yǎng)對照葉片。總蛋白提取時, 預(yù)冷研磨器具及其他需要接觸到樣品的工具; 樣品加入液氮研磨, 加入含0.2% DTT的10% TCA-丙酮(w/v) (–20℃預(yù)冷), 充分混合, –20℃沉淀2 h, 20,000×, 4℃, 離心30 min; 棄上清, 取沉淀; 沉淀用含100 mmol L–1醋酸銨的80%甲醇溶液洗1次, 80%丙酮洗1次, 通風(fēng)櫥內(nèi)室溫干燥10 min; 加入10 mL酚/SDS抽提液振蕩混勻溫育5 min, 4℃, 20,000×離心10 min, 轉(zhuǎn)移上層酚相至干凈新管中, 加入5倍體積的預(yù)冷的含100 mmol L–1醋酸銨的甲醇溶液, –20℃沉淀4 h或過夜, 20,000×離心10 min, 棄上清液, 沉淀中再加入預(yù)冷的80%甲醇和80%丙酮各一次, 懸起沉淀并充分清洗后將溶液吸出, 通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干, –80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0 mL酚/SDS抽提液: pH 8.0 Tris飽和酚與SDS緩沖液(30%蔗糖、2% SDS、5% β-巰基乙醇、0.1 mol L–1pH 8.0 Tris-HCl)等量混合。

1.5 蛋白質(zhì)裂解與定量

采用Bradford[12]法對蛋白進行定量。稱取20 mg蛋白質(zhì)干粉加入200 μL裂解緩沖液, 30℃水浴1 h, 14℃、20,000×離心30 min, 取上清液即為葉片總蛋白溶液, 測定蛋白濃度, 每個樣品測量3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 蛋白組學(xué)測定

按照美國AB Sciex公司生產(chǎn)的iTRAQ Reagent 8 Plex Multi-plex試劑盒說明書, 對2組共計12個蛋白質(zhì)樣品進行酶解與標(biāo)記。混合標(biāo)記后的樣品用gemini NX (Phenomemex, 00F-4453-E0)色譜柱進行分級, 隨后用1100系列高效液相色譜儀(Agilent公司, 美國)和Orbi-trap Elite質(zhì)譜儀(Thero Scientific公司, 美國)進行液相分離和質(zhì)譜分析[15-16], 此部分工作由上海維基生物科技有限公司承擔(dān)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

1.7.1 原始數(shù)據(jù) 根據(jù)鑒定蛋白質(zhì)的FASTA格式序列文本, 利用Compute pI/Mw工具計算每一個蛋白質(zhì)的分子量和等電點, 將定量及鑒定結(jié)果進行合并處理, 采用GO數(shù)據(jù)庫的注釋對鑒定蛋白質(zhì)的功能進行分類。MS/MS數(shù)據(jù)通過搜索NCBI和EST數(shù)據(jù)庫。搜索條件: 胰酶消化, 最大遺漏酶切位點1個, 肽段質(zhì)量精確度1×10–3%, MS/MS 質(zhì)量精確度±0.50 Da, 固定修飾Carbamidomethyl (C)。根據(jù)蛋白質(zhì)譜搜庫檢索和差異蛋白篩選結(jié)果, 進行Blast分析。

1.7.2 GO分析及KEGG代謝通路分析 所有鑒定差異表達蛋白通過ID號到Unipro數(shù)據(jù)庫中批量獲取對應(yīng)的注釋文件(*.dat) FASTA文件, 在Customize選項中選Geneontology鏈接到GO數(shù)據(jù)庫, 得到每個蛋白的GO注釋信息。將差異表達蛋白的FASTA格式文件上傳到KOBAS2.0中, 選擇map到KO中, 得到差異表達蛋白所對應(yīng)的KO號, 根據(jù)所得到的KO號在KEGG ORTHOLOGY數(shù)據(jù)庫中做代謝通路分析, 得到差異表達蛋白質(zhì)作圖到各個通路上的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

干旱脅迫處理對2個青稞品種的葉綠素含量產(chǎn)生了不同的影響(圖1)。干旱脅迫后的2個品種的葉片葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素含量與對照相比呈逐漸降低的趨勢, 干旱脅迫時間越久, 葉綠素含量對比對照降低越多, 其中大麻青稞葉片葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素含量的降低趨勢更為明顯, 說明在重度干旱脅迫時大麻青稞葉片的光合能力受到的抑制明顯高于旱地紫青稞。

A: 葉綠素; B: 葉綠素; C: 總?cè)~綠素。大寫字母表示0.01極顯著水平, 小寫字母表示0.05顯著水平。

A: chlorophyll; B: chlorophyll; C: total chlorophyll. Uppercase letters indicate extremely significant differences at the 0.01 proba-bility level, lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

2.2 可溶性蛋白質(zhì)含量

干旱脅迫條件下, 旱地紫青稞和大麻青稞葉片可溶性蛋白質(zhì)含量隨干旱脅迫時間的延長呈逐漸降低的趨勢(表1), 干旱脅迫第7天旱地紫青稞葉片可溶性蛋白質(zhì)含量降低為對照的94.38%, 干旱脅迫第10天, 降低為對照的92.47%。大麻青稞葉片在干旱脅迫第7天可溶性蛋白含量降低為對照的78.70%, 干旱脅迫第10天, 降低為對照的76.50%, 降低趨勢明顯大于旱地紫青稞。推測可溶性蛋白與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)有關(guān), 高含量的可溶性蛋白可使細(xì)胞維持較低的滲透勢, 抵抗水分脅迫帶來的傷害, 但是當(dāng)水分虧缺嚴(yán)重到影響了植物蛋白合成代謝時, 可溶性蛋白含量就會下降。由此可以看出, 旱地紫青稞比大麻青稞具有更強的抗?jié)B透脅迫能力。

2.3 相對電導(dǎo)率和丙二醛含量

干旱脅迫處理后, 旱地紫青稞葉片及大麻青稞葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均呈現(xiàn)增高趨勢(表1)。但在相同干旱脅迫下大麻青稞葉片的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量增加趨勢更加明顯, 證明其細(xì)胞膜遭到破壞更大, 導(dǎo)致膜透性增大, 電解質(zhì)外滲更多, 同時膜脂過氧化程度更高, 釋放出的丙二醛還會抑制蛋白合成, 從而增加細(xì)胞的滲透勢。這些結(jié)果表明, 大麻青稞膜系統(tǒng)對干旱脅迫的耐受程度明顯低于旱地紫青稞。

2.4 蛋白鑒定

分別對干旱處理10 d (HDZD)和正常水分培養(yǎng)(HDZCK)的旱地紫青稞葉片及干旱處理10 d (DMD)和正常水分培養(yǎng)(DMCK)的大麻青稞葉片, 采用iTRAQ技術(shù)進行蛋白質(zhì)的定性定量工作, 共鑒定出蛋白質(zhì)及多肽4163個。由表2可知, 肽段覆蓋率在10%以下的蛋白占鑒定總蛋白的30.55%, 肽段覆蓋率在10%~20%的蛋白占鑒定總蛋白的37.45%, 肽段覆蓋率在20%~30%以上的蛋白占鑒定總蛋白的19.19%, 肽段覆蓋率在30%~40%以上的蛋白占鑒定總蛋白的8.82%, 肽段覆蓋率在40%以上的蛋白占鑒定總蛋白的4.01%, HDZD- HDZCK比較組葉片經(jīng)過質(zhì)譜分析共測出蛋白質(zhì)及多肽共2150個, DMD- DMCK比較共測出蛋白質(zhì)及多肽2013個。

表1 干旱處理對青稞葉片蛋白質(zhì)、相對電導(dǎo)率及丙二醛含量的影響

大寫字母表示0.01極顯著水平, 小寫字母表示0.05顯著水平。

Uppercase letters indicate extremely significant differences at the 0.01 probability level; lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

表2 鑒定蛋白的覆蓋率分布

2.5 差異表達蛋白

根據(jù)實驗條件篩選并注釋了4163個差異蛋白, 對每個蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)以2為底數(shù)取其對數(shù), 以此作為橫坐標(biāo), 用值以10為底取其對數(shù)的絕對值為縱坐標(biāo), 做出差異蛋白的火山圖(圖2)。結(jié)果顯示, 2個品種青稞的差異表達蛋白總數(shù)是184個, 其中, HDZD-HDZCK比較組中表達上調(diào)的蛋白68個, 表達下調(diào)的蛋白63個, 共131個。蛋白含量相差4.0倍以上的有4個, 其中最大為7.495倍。含量相差3.0倍以上的有11個, 相差3.0~2.0倍的有17個, 相差1.9~1.0倍有31個。在DMD-DMCK比較組中表達上調(diào)蛋白21個, 表達下調(diào)蛋白32個, 共53個。蛋白含量相差3.0倍以上的有1個, 含量相差2.9~2.0倍2個, 含量相差1.9~1.0倍有13個。

2.6 差異表達蛋白的生物信息功能分析

2.6.1 青稞差異蛋白GO富集分析 對差異蛋白主要功能進行GO功能注釋, 分析結(jié)果如圖3, 差異蛋白的生物學(xué)功能覆蓋范圍分布較廣。HDZD-HDZCK對照組中, 分子功能類占比66%, 主要涉及催化活性及結(jié)合等功能; 生物過程類占比17%, 主要涉及生物合成過程、細(xì)胞過程以及代謝過程; 細(xì)胞組成類占比17%, 主要涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及大分子復(fù)合物等細(xì)胞組分。DMD-DMCK比較組中, 分子功能類占比71%, 主要涉及催化活性及結(jié)合功能; 生物過程類占比14%, 主要涉及單一生物合成過程、代謝過程以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運過程等; 細(xì)胞組成類占比15%, 主要由細(xì)胞器、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物以及胞質(zhì)溶膠四部分組成。HDZD-HDZCK和DMD-DMCK的差異蛋白共有184個, 對其行使的功能進行分類, 可以分為12類(表3), 分屬于碳水化合物和能量代謝類、蛋白質(zhì)生物合成類、氧化還原類、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝類、蛋白質(zhì)代謝類、應(yīng)激與防御類、電子載體類等。

A: 屬于生物過程(BP); B: 屬于細(xì)胞組分(CC); C、D、E、F、G屬于分子功能(MF); A: 防御響應(yīng); B: 胞外部分; C: 催化活性; D: ATP結(jié)合; E: 結(jié)構(gòu)分子活性; F: 轉(zhuǎn)移活性; G: 運輸活性; H: 其他活性。

A: biological process (BP), B: cell component (cc), and C–G: molecular functions (MF). A: defense response; B: extracellular part; C: catalytic activity; D: ATP binding; E: structural molecule activity; F: transfer activity; G: transport activity; H: other activities.

表3 HDZD-HDZCKA和DMD-DMCK差異表達蛋白功能分類

2.6.2 差異表達蛋白的KEGG分析 通過對差異蛋白進行KEGG分析, 兩組對照注釋蛋白通路見圖4。其中占比最大的3條通路分別是代謝通路、氨基酸的生物合成以及次級代謝產(chǎn)物的生物合成。差異表達蛋白主要涉及13條代謝通路, 包括檸檬酸循環(huán)、光合作用、半胱氨酸和蛋氨酸等通路。其中表達上調(diào)和下調(diào)蛋白共同參與的途徑有6條, 半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路在干旱脅迫的2個品種中都表現(xiàn)為表達上調(diào)。在HDZD-HDZCK中, 與呼吸和光合作用相關(guān)的通路均顯著上調(diào), 其中包括三羧酸循環(huán)(TCA)、碳代謝、丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸的代謝以及光合作用中的碳固定通路; 在DMD-DMCK中, 關(guān)于蛋白質(zhì)的合成通路均顯著上調(diào), 其中包括核糖體組裝、RNA轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工以及可提供能量的氧化磷酸化通路。

表4 顯著差異蛋白的KEGG通路

3 討論

本研究以2份干旱脅迫耐受性不同的青稞品種(旱地紫青稞和大麻青稞)為研究材料, 對其葉綠素含量、可溶性蛋白含量等進行了生理指標(biāo)的測定, 其次采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù), 分析了干旱脅迫后的葉片全蛋白組的差異表達。

3.1 干旱處理對青稞葉綠素含量的影響

在干旱處理7 d和10 d后, 旱地紫青稞和大麻青稞葉綠素、及葉綠素總量對比對照均呈現(xiàn)為持續(xù)下降的趨勢, 與之前對馬鈴薯[17]、文冠果[18]等研究結(jié)果不同, 沒有出現(xiàn)抗旱性強的植物葉綠素含量隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢, 可能是由于不同植物內(nèi)葉綠素響應(yīng)干旱脅迫的機制存在差異, 但大麻青稞葉片葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素含量的降低趨勢更為明顯, 證明在重度干旱脅迫時大麻青稞葉片的光合作用能力受到的抑制高于旱地紫青稞。干旱組的2個品種的葉綠素含量較對照組比葉綠素含量下降趨勢明顯, 說明重度干旱脅迫會造成葉綠素分解, 葉綠素含量降低, 并且葉綠素相比較葉綠素對干旱脅迫更加敏感, 這與對徐銀萍等對大麥干旱脅迫后葉片的葉綠素研究結(jié)果一致[19]。

3.2 干旱處理對青稞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物受到干旱脅迫時, 會產(chǎn)生與抗逆活動相關(guān)的蛋白質(zhì)并會水解一些結(jié)構(gòu)蛋白以維持正常的生理需要, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量增加[20]。在正常生理環(huán)境下, 旱地紫青稞體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量低于大麻青稞。隨著干旱脅迫時間的延長, 2個品種青稞內(nèi)的可溶性蛋白含量均表現(xiàn)出先快后慢的下降趨勢, 大麻青稞蛋白質(zhì)含量的減少值和降低比例始終大于旱地紫青稞, 這與對甘薯研究結(jié)果相一致[21]。

相對電導(dǎo)率在衡量植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性中具有重要作用。在正常生理環(huán)境下, 旱地紫青稞的相對電導(dǎo)率低于大麻青稞的相對電導(dǎo)率。隨著干旱脅迫時間的延長, 兩個品種青稞的相對電導(dǎo)率均表現(xiàn)為先慢后快的增加趨勢, 這說明干旱脅迫破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性, 大量溶質(zhì)滲出, 導(dǎo)致相對電導(dǎo)率增大, 這種現(xiàn)象在易家寧等[22]對紫蘇以及鄧輝茗等[23]對綿毛水蘇幼苗的水分脅迫的研究中都得到了印證。

丙二醛含量主要反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度, 含量越高細(xì)胞膜脂過氧化程度越高, 細(xì)胞膜穩(wěn)定性越差[24]。在正常生理環(huán)境下, 旱地紫青稞的丙二醛含量高于大麻青稞。隨著干旱脅迫時間的延長, 前者的丙二醛含量持續(xù)上升, 而大麻青稞的丙二醛含量的增加呈現(xiàn)出先慢后快的趨勢, 并且在干旱處理10 d的時候, 其丙二醛含量超過了旱地紫青稞。由此暗示, 旱地紫青稞中的細(xì)胞膜能維持相對的穩(wěn)定性, 受干旱影響較小。

3.3 干旱處理對青稞蛋白表達的影響

本研究共篩選到184個差異表達蛋白, 其中上調(diào)表達蛋白89個, 下調(diào)表達蛋白95個。旱地紫青稞和大麻青稞表達差異量最高的蛋白質(zhì)分別是異檸檬酸裂解酶和β-1,3-葡聚糖酶, 上調(diào)倍數(shù)分別是16.64和24.03; 最顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)是DUF3700 domain-containing protein以及DUF3479 domain-containing protein, 下調(diào)倍數(shù)分別為7.69和2.25。D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS), 脫水蛋白及BURP domain-containing protein等蛋白質(zhì)在2個品種的青稞中的表達量均上調(diào), 同時脂氧合酶、類萌發(fā)蛋白等蛋白質(zhì)也出現(xiàn)不同程度的差異表達。

異檸檬酸裂解酶在旱地紫青稞中上調(diào)表達倍數(shù)最大, 為16.64倍。異檸檬酸裂解酶是乙醛酸循環(huán)體中特有的酶, 可將異檸檬酸裂解為琥珀酸和乙醛酸。后期生成的草酰乙酸可參加機體內(nèi)的能量代謝過程或生成其他代謝物質(zhì), 乙醛酸循環(huán)可將油脂轉(zhuǎn)化為糖類[25]。目前有關(guān)異檸檬酸裂解酶在非生物脅迫下的作用研究還較少, 而本實驗中在旱地紫青稞中異檸檬酸酸裂解酶含量顯著上調(diào), 其作用可能是在干旱脅迫下為機體供能以維持正常的生理代謝, 防止植物受到損害, 同時可能是利用乙醛酸循環(huán)將油脂轉(zhuǎn)化為糖類, 可增強細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。

在大麻青稞中受干旱脅迫上調(diào)表達倍數(shù)最高的蛋白為β-1,3-葡聚糖酶, 上調(diào)24.03倍, 其隸屬于糖基水解酶, 參與植物體的器官發(fā)育、果實成熟及衰老等重要生命活動[26]。之前的研究結(jié)果顯示, β-1,3-葡聚糖酶可提高植物的抗病性[27-28]、還可受到低溫脅迫[29]、水楊酸、乙烯等外源植物激素的誘導(dǎo), 增強植物的抗性。徐小萍等[29]對三明野生蕉低溫處理發(fā)現(xiàn)該酶對低溫的響應(yīng)活性不僅存在時間的臨界點, 還存在溫度臨界點, 在短時間內(nèi)對低溫響應(yīng)強烈, 且僅在某一臨界溫度下響應(yīng)低溫脅迫, 是一種低溫保護酶[30]。在其他非生物脅迫中, β-1,3-葡聚糖酶的研究還知之甚少, 尤其是在干旱脅迫下, 發(fā)揮怎樣的作用及其作用機理, 也是需要后期著重研究的內(nèi)容。

D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS), 在旱地紫青稞和大麻青稞的干旱組中表現(xiàn)為表達量上調(diào), 上調(diào)倍數(shù)分別是2.40和2.15, 在旱地紫青稞的表達量略高。P5CS是合成脯氨酸的關(guān)鍵酶, 而脯氨酸是植物內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 在非生物脅迫下發(fā)揮重要的作用[31]。前人已對煙草[32]、菜豆[33]、枸杞[34]、堿蓬[35]中的P5CS基因進行研究, 發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫以及ABA脅迫處理后表達上調(diào)、抗性增強。堿蓬的基因?qū)霐M南芥并過量表達, 干旱脅迫后, 發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸含量增加, 丙二醛的含量顯著降低, 擬南芥抗旱性增加, 說明P5CS是一種受干旱脅迫的正調(diào)控的蛋白[35]。

DUFs雖然是一類功能還未研究透徹的蛋白家族, 但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)DUFs在植物正常生長發(fā)育、生物脅迫防御以及響應(yīng)環(huán)境逆境危害等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[36]。在不同作物中, DUFs受到不同非生物脅迫的調(diào)控。擬南芥的DUF6對鹽、干旱脅迫敏感[37]; 玉米的DUF642受酸鋁脅迫調(diào)控[38]; 小麥的DUF860響應(yīng)熱脅迫[39]; 沙冬青的DUF1517具有一定的抗寒作用[40]; 水稻中的DUF則受到干旱脅迫調(diào)控[41]。大量實驗證據(jù)表明, DUFs受到非生物脅迫的正調(diào)控, 但在本次實驗中, 受到干旱脅迫的旱地紫青稞和大麻青稞的DUF3700和DUF3479蛋白均呈下調(diào)表達, 下調(diào)倍數(shù)分別是7.69倍和2.22倍, 這與現(xiàn)有的研究報道結(jié)果不相一致, 可能與在青稞中的其他調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān), 還需要后續(xù)在其他組學(xué)中進行比對分析其原因。

DHNs是LEA蛋白第二家族成員, 因其C端有一段保守的K片段, 在植物失水時可以形成a-螺旋, 以防止細(xì)胞膜受損以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變形[42]。DHN5在‘旱地紫’青稞和DHN8在‘大麻’青稞的干旱組中均表現(xiàn)為表達量上調(diào), 分別上調(diào)2.89倍和15.65倍。DHNs雖均屬于同一個家族, 但其功能及作用機理不盡相同[43], 有主要受干旱和ABA誘導(dǎo)表達的, 有被低溫和寒冷誘導(dǎo)型, 也有與植物抗旱和抗旱相關(guān)型, 在植物中多表現(xiàn)為組成型行使其抗逆功能。在小麥中, 表現(xiàn)為對干旱和鹽脅迫有響應(yīng)[44-45], 對冷脅迫下的大麥也表現(xiàn)出有增強其抗逆性的作用[46], 在擬南芥中過表達的DHN5還可參與到JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中, 下調(diào)3個JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子JAZ家族成員的蛋白表達, 從而增強其對植物病原菌的防御作用[47]。在早稻中的DHN8可受干旱和高鹽誘導(dǎo)表達, 但不受低溫誘導(dǎo)表達。DHN5及DHN8在這兩種青稞種質(zhì)中抵御脅迫時的作用機理可能存在差異, 且其表達量上調(diào)倍數(shù)相差懸殊, 但具體機理不明, 這是后續(xù)需要著重研究的部分。

脂氧合酶(LOX)催化以亞油酸、亞麻酸等多元不飽和脂肪酸為底物的膜脂過氧化反應(yīng), 生成氫過氧化物, 破壞膜的完整性[48]。馬明杰等[49]通過對冷敏性蔬菜青椒低溫處理, 發(fā)現(xiàn)LOX活性增加, 說明LOX對低溫敏感, 活性增強后破壞膜脂從而破壞膜的完整性, 導(dǎo)致青椒的冷敏性。王成慧[50]通過轉(zhuǎn)基因手段將甜瓜轉(zhuǎn)入擬南芥, 并構(gòu)建沉默植株以及過表達植株, 進行干旱處理后發(fā)現(xiàn)過表達植株LOX活性升高, 過氧化氫含量降低, 減少了氧化傷害, 增強了植株的抗旱性; 而沉默植株LOX活性降低, 過氧化氫積累, 對干旱脅迫敏感。孫婷婷等[51]將甘蔗的基因?qū)氡臼蠠煵葜? 在氯化鈉和PEG處理后, 該基因表達量顯著上升, 增強了植物的抗旱性。本次實驗中, LOX的活性在旱地紫青稞中表達下調(diào), 在大麻青稞中相反, 說明在大麻青稞中LOX的活性更容易受到干旱脅迫的調(diào)控, 推測與大麻青稞是干旱敏感型有關(guān)。通過比較二者干旱第7天與第10天的電導(dǎo)率結(jié)果發(fā)現(xiàn), 這與干旱脅迫下大麻青稞的電導(dǎo)率高于同等處理時間旱地紫青稞變化的生理狀態(tài)一致。

類萌發(fā)素蛋白(GLPs)是一種植物體內(nèi)普遍存在的可溶性糖蛋白, 既可以作為酶和結(jié)構(gòu)蛋白催化調(diào)控植物體內(nèi)生理反應(yīng), 也可作為受體參加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[52]。GLPs在兩個品種青稞中的表達結(jié)果相反, 在旱地紫青稞中下調(diào)表達, 下調(diào)1.92倍; 在大麻青稞中表達上調(diào), 上調(diào)倍數(shù)是2.19。之前的研究發(fā)現(xiàn), GLPs既可以通過介導(dǎo)細(xì)胞壁增厚來阻止病原菌入侵響應(yīng)生物脅迫, 也可以對鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫[53]以及重金屬[54]等非生物脅迫做出具有組織特異性的應(yīng)答。Hurkman等[55]在研究鹽脅迫大麥幼苗時發(fā)現(xiàn), 在大麥幼苗受到鹽脅迫時, 僅在根部特異性上調(diào)GLPs表達。本次實驗GLPs的差異表達說明旱地紫青稞中類萌發(fā)蛋白對干旱脅迫的敏感程度低于大麻青稞, 這也可能與旱地紫青稞的耐旱性強于大麻青稞有關(guān)。

4 結(jié)論

干旱脅迫對青稞的生長和代謝具有一定的破壞, 從而導(dǎo)致青稞減產(chǎn)減量。干旱脅迫致使青稞葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降, 膜脂過氧化程度升高, 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累, 葉綠素含量降低, 影響了青稞的正常生理代謝過程。異檸檬酸裂解酶、β-1,3-葡聚糖酶、D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、類萌發(fā)素蛋白等代謝物也出現(xiàn)顯著差異表達的現(xiàn)象, 通過表達的上調(diào)或下調(diào), 增加青稞的抗逆性, 使其在干旱環(huán)境中足以存活且保證一定的產(chǎn)量。

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Differentially expressed protein analysis of different drought tolerance hulless barley leaves

LI Jie**, FU Hui**, YAO Xiao-Hua, and WU Kun-Lun*

Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Qinghai University / Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences / Qinghai Key Laboratory of Hulless Barley Genetics and Breeding / Qinghai Subcenter of National Hulless Barley Improvement, Xining 810016, Qinghai, China

In order to reveal the differences in response to drought stress among different hulless barley varieties from the protein level and to analyze the protein molecular mechanism of drought tolerance, Handizi Barley (HDZ) resistant to drought stress and Dama Barley (DM) sensitive to drought stress were used as research materials in this study. Drought treatment were determined by potted-planting method with limited water supply, four physiological indexes of hulless barley leaves with different drought gradients, including chlorophyll, soluble protein, malondialdehyde content, and relative conductivity were investigated. iTRAQ technology was used to conduct differential protein analysis on the whole protein group of barley leaves under deep drought stress. The results showed that with the extension of the drought treatment, the chlorophyll and soluble protein content of two hulless barleys under drought stress gradually decreased, the electrical conductivity and malondialdehyde content gradually increased, and the decrease in chlorophyll and soluble protein content, the increase in electrical conductivity and the content of malondialdehyde in Dama were greater than that of Handizi; 4163 proteins (polypeptides) were quantified, among them, compared with normal culture in the Handizi comparison group, 68 up-regulated proteins and 63 down-regulated proteins were screened by iTRAQ; in the comparative group of Dama, 21 up-regulated proteins and 32 down-regulated proteins were screened. KEGG pathway showed that the top three enrichment pathways were metabolic, amino acid biosynthesis, and secondary metabolite biosynthesis. The first one mainly related to citric acid cycle, carbon cycle, and other metabolic pathways. The synthesis and degradation of amino acids were mainly involved arginine and alanine. The synthesis of secondary metabolites were about arachidonic acid and linolenic acid. This study screened the proteins related to the metabolic pathways and other related functions in response to drought stress on proteome level in hulless barley, providing a theoretical basis for revealing the molecular regulation mechanism in response to drought stress.

hulless barley; drought stress; leaf; differentially expressed protein; iTRAQ

10.3724/SP.J.1006.2021.01062

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(32060480, 31660388, 31960427), 青海省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新基金(2018-NKY-12), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-05)和青海省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2019-ZJ-7075)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32060480, 31660388, 31960427), the Qinghai Provincial Academy of Agriculture and Forestry Innovation Fund (2018-NKY-12), the China Agriculture Research System (CARS-05), and the Qinghai Science and Technology Support Project (2019-ZJ-7075).

吳昆侖, E-mail: wklqaaf@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

E-mail: lij_28257@163.com

2020-08-05;

2020-12-01;

2021-01-04.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210104.1355.010.html