中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒檢測方法研究進展

（重慶師范大學生命科學學院，401331）

1 引言

蜜蜂在維持自然生態平衡和生態農業，供給人類高營養和保健功能蜂產品的過程中扮演重要角色[1]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是我國獨特的蜜蜂資源，具有極強的耐寒性和抗螨性，因此中蜂對于農業生產以及花卉植物的冬季繁殖具有不可替代的作用。但近十年來，由于各種原因，世界各地的蜜蜂大量流失，嚴重威脅各國的養蜂業、生態平衡和農村農業生產[2]。然而我國中華蜜蜂生存所受到的主要威脅則是中蜂囊狀幼蟲病，如何減少蜂群的流失已成為各國政府和科學家面臨的重要課題[3]。

蜜蜂囊狀幼蟲病病毒（SBV）是一類正鏈單股昆蟲RNA 病毒，被劃入傳性軟腐病毒科（Iflavirus）、腸道病毒屬（EV）。該病毒基因組除去Poly A尾約有8832個堿基，有一個較大編碼框（ORF），其編碼約有2860個氨基酸殘基的Polyprotein[4]。在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下，Polyprotein的-NH2末端被剪切后加工產生成熟的結構蛋白，-COOH端剪切后加工產生為非結構蛋白。感染SBV的A.cerana.cerana所攜帶的病原稱中蜂囊狀幼蟲病毒，SBV最早是在西方蜜蜂患病幼蟲（Apis mellifera）中報道，但對東方蜜蜂（Apis cerana,Fabricius）（包括A.cerana cerana）的危害更為嚴重[5]。其主要感染蜜蜂的幼蟲，使其不完全蛹化且蛹內充滿病毒粒子[6]。當損害嚴重時，大量幼蟲會因感染而死亡，同時成蟲為維護蜂群的生存環境而清理病死的幼蟲，在清理過程中被感染SBV的成蟲雖無癥狀，但活動能力下降以致種群優勢減弱，最終導致種群的滅絕[7]。據報道，SBV先后對泰國、韓國、日本和中國的A.cerana種群及養蜂產業形成無法挽回的損失[8-14]，目前A.cerana cerana蜂群囊狀幼蟲病的發病率仍在50%～70%[15]。

本文主要介紹CSBV檢測方面的研究成果，以期為我國中蜂囊狀幼蟲病的診斷、預防和檢疫以及蜂產品病原菌污染的檢測提供快速、準確、簡便的檢測思路。

2 臨床診斷方法

臨床診斷方法只適用于已感染SBV的幼蟲并致幼蟲發病的蜂群，其癥狀表現為蜂箱外側發現明顯的病死幼蟲，同時可觀察到巢脾內部死亡幼蟲逐一被清潔蜂拖出巢房；患病蜂群的巢脾出現明顯的“插花子脾”現象[16]，同一巢脾且尚未封蓋巢房內的幼蟲皮下滲出液增多，從患病到死亡體表顏色由白色逐漸變為淺黃色，最后變為棕褐色；病死幼蟲水分蒸發后，用鑷子夾起會呈現小囊狀或袋狀外觀[17]。然而，臨床診斷法適用于幼蟲發病的蜂群而成年蜜蜂感染病毒之后沒有明顯癥狀，故此法不適用于蜂群隱形感染的情形。

3 電子顯微鏡檢測方法

電子顯微鏡檢測法是較為常見的檢測蜜蜂囊狀幼蟲病毒的手段。楊冠煌以及馮建勛等[18,19]對CSBV提純后，制備高濃度、高純度的CSBV，再借助電子顯微鏡對CSBV進行了觀察，發現CSBV粒子直徑大約26～30nm的球狀病毒粒子。該法操作簡單，但實驗設備的要求高。

4 PCR檢測方法

隨著基因組生物學的快速發展，聚合酶鏈式反應技術（PCR）日益成熟。PCR是一類特定基因或克隆序列的體外酶促擴增技術。近幾年來自世界各地的研究人員也對該技術進行了改進，目前已有10余種不同類型的PCR技術廣泛應用于生物學的各個領域。

RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的PCR相結合的技術。該技術目前是鑒定CSBV最常用的方法，RT-PCR技術因其高靈敏度可檢測出極低拷貝數的RNA樣本。根據NCBI上已發布的CSBV序列，研究人員可設計相應的特異性引物，從疑似受感染蜂群中擴增出對應條帶，若擴增出條帶所測得序列與CSBV序列一致，則可確診疑似蜂群感染CSBV。截至目前，已有多名研究人員利用該方法檢測CSBV。李明等[20]利用GenBank上已發布的CSBV基因組設計引物，運用RT-PCR技術，檢測出遼寧地區的蜜蜂存在CSBV病毒，并將遼寧地區的CSBV部分基因序列與廣東的CSBV基因序列進行對比，發現遼寧的CSBV與廣東的CSBV基因序列對應區段具有94%的同源性。沈克飛等[16]選取CSBV基因組序列中的RNA依賴的RNA聚合酶基因序列，開發了CSBV半套式RT-PCR檢測方法，且特異性較高。周亮等[4]根據SBV全序列設計引物，利用RT-PCR技術檢測出該病毒，并將部分基因序列片段與廣東的SBV序列進行比對，兩者同源性高達96.8%。沈克飛等[21]使用SB14F/SB15R引物運用RT-PCR技術檢測了重慶、浙江和云南地區蜜蜂幼蟲中SBV的感染率，表明SBV在不同地區對蜜蜂種群的危害程度不同，在重慶地區中華蜜蜂呈流行趨勢，而浙江中華蜜蜂、云南西方蜜蜂呈低感染狀態。曹蘭等[15]使用SB14F/SB15R[22]引物擴增RdRp基因序列，利用該基因片段對SBV進行基因型分析，發現所擴增片段序列與CSBV序列同源性高于95%，與SBV同源性高于89%。該病毒主要分為歐洲型、遠東型和南非型3個基因型，揭示SBV總體上按地域分型。Kerstin Wernike等[23]第一次利用TaqMan MGB探針qRT-PCR的方法對SBV進行了檢測和定量。宋戰昀等[24]針對SBV保守區設計出一對特異性引物和一條探針，開發了快速檢測SBV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，可對低病毒含量的樣品進行準確檢測和蜜蜂制品中蜜蜂囊狀幼蟲病毒污染的檢測。馬鳴瀟等[25]也采用TaqMan PCR檢測了CSBV，同樣表明TaqMan PCR具有較高的特異性、敏感性和穩定性。根據上述研究人員的工作，本文匯總了RT-PCR技術檢測靶標、引物及反應條件（表1）。

表1 RT-PCR引物及條件

4.1 Nested-PCR技術

巢式PCR（Nest-PCR）是一種異化聚合酶鏈式反應，且在該病感染早期可快速檢測SBV。Nested-PCR技術的兩對特異性引物分別對靶片段進行擴增而獲得目的產物，該檢測技術極大降低了非特異性擴增的幾率。許益鵬等[26]根據病毒保守區設計套式引物（表2），通過RT-PCR結合Nest-PCR的方法擴增病毒的特征核苷酸區域，將擴增產物序列與該病毒已公布的其他序列進行比對，表明該段序列和我國廣東遞交的SBV序列的對應區段有90%～95%的同源性；而在氨基酸水平上有97%～98%的同源性。序列分析也表明，不同的地理種群蜜蜂囊狀幼蟲病毒基因組序列都有所不同。在實際應用中，常用外嵌套引物（F1+R1）和內嵌套引物（F2+R2）做2個反應即足以判斷。

表2 巢式PCR引物及條件

表3 RT-PCR及梯度條帶PCR引物

4.2 PCR技術

梯度PCR技術可同時進行多個不同退火溫度的擴增反應，短時間內對PCR實驗條件優化并確定特定體系相應的最優退火溫度。劉新宇等[27]根據GenBank中已知的CSBV序列，針對CSBV分別設計了用于傳統RT-PCR技術的4對特異性引物和用于梯度條帶RTPCR技術的5對特異性引物（表3）。利用兩種技術分別對陜西南部、陜西北部及關中的健康蜂群和CSBV感染蜂群進行染病鑒定，表明針對陜西三個地區檢測，傳統RT-PCR技術和梯度條帶RT-PCR技術鑒定結果相同，且與已知序列CSBV的同源性在93%～96%之間。但與傳統的RT-PCR鑒定方法相比，梯度條帶PCR方法獲得結果直觀、鑒定費用少、檢測效率高。梯度條帶PCR技術在電泳檢測階段即可通過DNA片段的梯度次序確定是否存在病毒，從而加快了病毒在宿主體內的檢測周期。

4.3 多重引物PCR

多重引物PCR又稱復合PCR，在同一PCR反應體系中加上多種病原微生物的特異性引物進行PCR擴增，可同時檢測多種病原體或鑒定出是特異型病原體感染。林麗花等[28]根據GenBank的CSBV全基因組序列設計特異性引物（表4），采用二重PCR對同時感染CSBV和N.ceranae的樣本進行鑒定。結果表明，二重PCR擴增序列與已知兩物種序列的同源性均在92%～96%，與單一PCR具有相近的靈敏度和精度。

4.4 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（LAMP），是一類適用基因診斷的恒溫核酸擴增技術。主要是針對靶基因設計特異引物[29]，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，在60℃～65℃恒溫擴增，較短時間即可實現109～1010倍的擴增倍數，該技術對儀器設備要求低，水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，而且操作簡單、特異性強、產物易檢測。Smet等[30]基于MLPA技術建立了蜜蜂醫生（BeeDoctor）多功能診斷工具，可同時檢測10種蜜蜂病毒。楊金龍等[31]采用逆轉錄環介導等溫擴增技術RT-LAMP檢測東方蜜蜂囊狀幼蟲病毒，表明65℃水浴20min就能檢測到SBV，并且由于擴增核酸濃度的增加可引起顏色變化，肉眼即可看到陽性擴增反應，實現快速檢測。馬鳴瀟等[29]比較了LAMP和聚合酶PCR方法在31種病蜂樣品中的檢測效率，LAMP方法的檢測限為1pg。王向輝[32]等根據SBV-UK株多聚蛋白基因序列，選保守區域設計4條特異性引物，通過LAMP real-time Turbidimeter儀對SBV的反應體系和條件進行檢測和實時監控。表明，在63℃恒溫擴增40min后，其特異性與常規PCR檢測SBV一致；LAMP體系檢測最低濃度為32拷貝/μl；提取的SBV核酸進行LAMP擴增，顯示最大擴增速率的重復率均小于10%，表明LAMP檢測方法具有良好的重復性和穩定性（表5）。

表4 多重引物PCR引物及條件

表5 LAMP-PCR引物

4.5 基因芯片技術

2006年10月26日，美國蜜蜂基因測序聯盟（HGSC），在《Nature》雜志上公布了意大利蜜蜂基因組的測序結果[33]，同時，由Robinson等研制的西方蜜蜂頭部cDNA芯片和全基因組寡核苷酸芯片相繼問世[34]，從此標志著蜜蜂研究進入后基因組時代[35]。Glover等[36]利用寡核苷酸微列陣芯片技術同時檢測了西方蜜蜂感染的9種病毒。寡核苷酸微陣列技術已被證明可檢測一系列宿主中的多種病原體[37,38]。楊喻曉[39]等利用基因芯片在分子水平上研究中華蜜蜂的抗螨機理，對加快養蜂品種選育，尋找新基因、疾病診斷、藥物篩選等均具有重要價值。

5 免疫學診斷方法

免疫學診斷是建立在抗原與相應抗體發生可見反應這一原理的基礎上，基于病毒中的蛋白設計表位疫苗、制備相應抗體或是研制血清試劑盒而研發出免疫診斷方案[40]。免疫學方法具有較高的敏感性和特異性，在傳染病診斷、病原微生物鑒定以及抗原分析等方面，均有較廣泛的應用。目前用于蜜蜂傳染病診斷的主要有瓊脂免疫擴散法、膠體金免疫快速診斷技術和酶聯免疫吸附法（ELISA）[41]。張鶴[42]利用抗CSBV單克隆抗體建立了瓊脂擴散的檢測方法。夏曉翠等[43]通過原核表達CSBV-RDRP蛋白，并免疫新西蘭兔制備其多克隆抗血清，該抗血清能特異結合感染CSBV的A.cerana cerana血淋巴細胞，為進一步研究CSBV在A.cerana cerana其他組織中的分布和定位提供依據。李游等[44]以CSBV江西株為研究對象，制備了針對CSBV的單克隆抗體與多克隆抗體，并在此基礎上結合膠體金免疫層析技術，采用單抗與多抗的雙抗體夾心法初步研制了針對CSBV的膠體金快速檢測試紙，表明所制試紙能檢測出幼蟲體內的SBV病毒。李芳兵[45]等建立了用CSBV的結構蛋白VP2作為包被抗原替代CSBV病毒對抗CSBV的VP2卵黃抗體進行檢測的間接ELISA方法，該方法的建立為CSBV生物制劑的進一步研發以及檢測提供了新的思路。李明等[46]以分離到的CSBV基因為基礎，篩選出抗原性較好的融合蛋白代替CSBV作為免疫原，制備單克隆抗體，成功研制了雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，最小檢出量為3.675×10t copies/ul，變異系數均小于5%，雙抗夾心ELISA檢測方法與RT-PCR方法的陽性符合率為88.9%，說明建立的雙抗夾心ELISA檢測方法具有很好的檢測效果。通過免疫注射蛋雞生產卵黃抗體及從卵黃中提取高純度的卵黃抗體（IgY），可用于相應疾病的預防和治療。馬鳴瀟等[47]則以中蜂囊狀幼蟲病毒為增殖模型制備了IgY，應用IgY對感染CSBV的蜂群進行治療，治愈率高達96.25%以上，并且使用方便、特異性強、起效快、不復發、無藥物殘留。

6 展望

蜜蜂疾病是影響養蜂生產發展的障礙，也是影響蜂產品產量和質量的重要因素。而在蜜蜂的飼養管理工作中，對病原體的鑒定工作是各項防治工作的基礎和依據。蜜蜂病毒病是所有攻擊蜜蜂的病原菌病中的一種，中蜂囊狀幼蟲病是由囊狀幼蟲病毒引起的一種對中華蜜蜂毀滅性危害的病害。該病傳播速度極快，危害極大，可造成30%～90%的蜂群損失，是中蜂養殖過程中的主要病害。目前對蜜蜂病害的防治相關研究還停留在臨床診斷階段，隨著近幾年該病害發病率有回升趨勢，由于臨床癥狀在初期不典型或者呈隱性感染，容易誤診，當出現明顯癥狀時，已經造成嚴重的經濟損失。因此，及時了解該病檢測的最新方法，有助于及時發現病害減少損失。

針對蜜蜂囊狀幼蟲病毒的檢測方法包括宏觀水平的臨床診斷技術與電鏡檢測方法，微觀水平的分子生物學檢測技術與免疫學檢測方法。在宏觀水平方面，臨床診斷技術可以較為快速、簡便、直觀觀察到感染SBV的幼蟲，但該技術一般用于蜜蜂感染晚期的檢測，對防治起不了太大作用；電鏡檢測方法則具有價格昂貴，對設備和操作人員的技術要求較高等缺點，目前主要用于科研方向。在微觀水平方面，分子生物學檢測技術如RT-PCR、LAMP和實時定量RT-PCR等憑借其特異性強、靈敏度高、操作簡便等特點，成為目前進行蜜蜂病毒學研究的主要工具，但蜜蜂的囊狀幼蟲病毒屬于小RNA樣正鏈病毒，這類病毒易變性強，穩定性差，分子生物學檢測技術在該類病毒檢測方面也僅局限于定量分析。免疫學檢測方法多數是用蜜蜂囊狀幼蟲病毒蛋白進行免疫獲取相應的多克隆抗體或單克隆抗體，其具有可行性強、靈敏度高、高效快速等特點，如瓊脂免疫擴散法、膠體金免疫快速診斷技術、CSBV雙抗夾心ELISA方法建立等，但SBV/CSBV無法在體外大規模化培養，陽性血清比較難獲得，使得免疫學檢測方法難于被大范圍推廣。總之，上述方法雖各具優缺點，很難在基層生產上推廣。但值得關注的是，在最新的研究中，研究人員已經研制出如膠體金試劑條、雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒等，既快速、簡便、高效又能夠在基層廣泛使用的檢測方法，同時，未來的發展趨勢可能集中于LAMPPCR技術，因為OmniAmp DNA聚合酶不但比LAMP中的Bst更穩定，更靈敏，不會被粗樣品中的成分所抑制，而且價格比Bst更低，大大降低了檢測成本。

因此，在蜂業生產過程中及時檢測并正確區分疾病病原，對于有效阻斷病原傳播、保障蜂產品質量具有十分重要的意義。隨著囊狀幼蟲病毒檢測技術在診斷蜜蜂疾病上的發展，尤其是對蜜蜂病原核酸序列的破譯，將會使病原的快速檢測與診斷成為可能。